2024年2月21日发(作者：)

中国海洋大学博士学位论文白斑综合症病毒（WSSV）的PCR检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究姓名：***申请学位级别：博士专业：水产养殖指导教师：董双林;黄倢20040601

刚吾白斑综合症病毒（ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ，ＷＳＳＶ）是迄今为止危害最为严重的一种对虾病毒。自１９９２年暴发以来，已在世界范围内传播开来，每年给对虾养殖业造成巨大经济损失，至今仍未得到完全控制，成为目前对虾养殖业可持续发展的主要障碍之一。十年来，人们对ＷＳＳＶ的传播途径进行了大量研究，发现了大量的ＷＳＳＶ宿主种类，确认了幼苗带病毒和水中浮游动物、池塘堤坡动物（如蟹类）和乌粪携带病毒等的主要传播途径。近些年来，人们在生产上除采用养殖抗病力强的种类（如凡纳滨对虾）外，还采用培育健康虾苗、限制一些鲜活饵料的使用、养殖用水消毒等措施，以切断ＷＳＳＶ的传播途径，使得养殖生产得到了一些恢复。但是，每年全国发病的面积比例仍然很大，特别是北方地区的损失仍然相当严重。其基本原因之一就是人们对ＷＳＳＶ传播的某些途径仍不十分清楚，致使某个（些）传播途径仍未被有效地切断。本研究采用灵敏、可靠的检测技术，结合具体的养殖实践，调查了ＷＳＳＶ在池塘养殖系统中的分布情况，并对池塘底泥中的轮虫休眠卵在传播ＷＳＳＶ中的作用和机制进行了初步研究，为今后有效杀灭ＷＳＳＶ提供了理论依据。本论文共包括五章，每一章又包括数量不等、相互独立的几篇文章，为保持每篇文章的相对独立性，在前言、材料与方法、参考文献等部分有所重复。由于本人学识有限，实验与论文难免存在疏漏和不妥之处，敬请各位专家悉心指正。作者２００４年４月１２日

自斑综台疰病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣｆｆ检测条件优化及浮游动物中问宿主韵调查研究白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究摘要白斑综合症病毒（ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｏｓ，ＷＳＳＶ）是迄今为止危害最为严重的一种对虾病毒。自１９９２年暴发以来，己在世界范围内传播开来，每年给对虾养殖业造成巨大经济损失，至今仍未得到完全控制，成为目前对虾养殖业可持续发展的主要障碍之一。十年来，人们对ＷＳＳＶ的传播途径进行了大量研究，确认了幼苗带病毒和水中浮游动物、池塘堤坡动物（如餐类）和鸟粪携带病毒等的主要传播途径。近些年来，人们在生产上除采用养殖抗病力强的种类（如凡纳滨对虾）外，还采用培育健康虾苗、限制一些鲜活饵料的使用、养殖用水消毒等措施，以切断ＷＳＳＶ的传播途径，使得养殖生产得到了一些恢复。但是，每年全国发病的面积比例仍然很大，特别是北方地区的损失仍然相当严重。其基本原因之一就是人们对ＷＳＳＶ传播的某些途径仍不十分清楚，致使某个（些）传播途径仍未被有效地切断。本研究采用灵敏、可靠的检测技术，结合具体的养殖实践，调查了ＷＳＳＶ在池塘养殖系统中的分布情况，并对池塘底泥中的轮虫休眠卵在传播ＷＳＳＶ中的作用和机制进行了初步研究，以期为今后有效杀灭ＷＳＳＶ提供理论依据。本文所得主要结果如下：设计了２对引物用于检测对虾白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ），外引物用于ＰＣＲ扩增，内引物用于合成探针进行斑点杂交。结果表明，外引物ＰＣＲ一电泳的检出极限为ｌｐｇＷＳＳＶＤＮＡ；ＰＣＲ产物经内探针斑点杂交，可检出ｌＯｆｇ的ＷＳＳＶＤＮＡ：单纯的内探针斑点杂交只能检测出］ｎｇ以上的ＷＳＳＶＤＮＡ。ＰＣＲ一斑点杂交的检测灵敏度比ＰＣＲ一电泳高２个数量级，比单纯斑点杂交高５个数量级。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明，ＰＣＲ一斑点杂交检测ＷＳＳＶ特异、可靠，该方法可用于痕量ＷＳＳＶ的检测。

自斑综台症病毒（ｗｓｓｖ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究ＰＣＲ检测对虾自斑综合症病毒过程中用尿嘧啶一ＤＮＡ糖基酶（ＵＮＧ）防遗留污染。使用ＵＮＧ时，该对引物的适宜ｄＵＴＰ和Ｍｇ”浓度分别为０．４ｍＭ和２．ＯｍＭ；ＵＮＧ存在时，ＰＣＲ检测Ｖ／ＳＳＶＤＮＡ的最低量为１Ｐｇ，ＵＮＧ的使用使ＰＣＲ的检测灵敏度降低了一个数量级；进行正常ＰＣＲ扩增前，０．５ＵＵＮＧ可消除至少ｌｏｎｇ含ｄｕ的ＷＳＳＶＤＮＡ的ＰＣＲ扩增产物。ＰＣＲ检测攻毒螯虾鳃样品时出现阴性，而经ｌＯ～１０５倍稀释后的样品却呈现阳性。结合核酸探针斑点杂交及组织切片结果，判断ＰＣＲ出现了假阴性，并推算出ＰＣＲ能够成功扩增的引物与模板的比例范围为２．４３×１０５—２．４３×１０”。探讨了ＰＣＲ出现假阴性的原因及防范措施。于２００２年采用ＰＣＲ一核酸探针斑点杂交法检测了乳山对虾养殖场１０００余份样品携带白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的情况，结果显示：６３９例对虾样品阳性检出率为２６．６％；７７例蟹类样品阳性检出率为１８．２％；２６６例浮游动物样品阳性检出率为３８．３％，３月份至９月份浮游动物阳性率呈下降趋势，消毒后水体中浮游动物的阳性率仍很高：３０例螺、贝样品及２２例抽滤海水样品检测均为阴性；２０４例底泥样品中，阳性检出率为１７．６％。２００２年在乳山养殖场采用两种围栏养殖模式养殖了中国明对虾和凡纳滨对虾，并对其防病效果进行了比较。结果表明，中国明对虾在养殖过程中ＷＳＳＶ阳性率逐渐增高，浮游动物ＷＳＳＶ阳性率一直很高；凡纳滨对虾在养殖过程中ＷＳＳＶ阳性率有下降趋势，浮游动物ＷＳＳＶ阳性率较低；布围隔的防病效果好于网围隔。采用ＰＣＲ一核酸探针斑点杂交法检测了对虾养殖池塘底泥中轮虫休眠卵及孵出轮虫携带ＷＳＳＶ的情况。表面消毒后的检测结果表明，ＷＳＳＶ极有可能存在于休眠卵的内部，轮虫休眠卵在对虾养殖池塘隔冬传播Ｖ／ＳＳＶ中可能起着重要Ｉ作用。对采于海水养殖池塘的壶状臂尾轮虫休眠卵及孵出轮虫进行了电镜观察。结果表明，轮虫休眠卵表面有明显的、不规则的褶皱突起，且附着一些污染物。轮虫细胞内线粒体、内质网密集。ＷＳＳＶ浸浴攻毒后轮虫出现细胞核及核仁膨大。初步研究了池塘轮虫休眠卵及其孵出轮虫传播白斑综合症病毒（Ｖ／ＳＳＶ）的２

白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ捡测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究可能性。以轮虫及其休眠卵粗提液注射淡水克氏原螫虾，结果注射轮虫休眠卵粗提液组未出现阳性，注射轮虫粗提液组出现１例阳性，表明轮虫有可能传播ＷＳＳＶ。关键词：白斑综合症病毒：ＰＣＲ一核酸探针斑点杂交；围栏养殖；轮虫休眠卵传播途径３

白斑综合症病毒（ｗＳＳｖ）的ＰｃＲ检测条件优化及浮游动物中问宿主的调查研究Ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ｗｓｓｖ）ＰｅＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎａｎｄｚｏｏｐｌａｎｋｔｏｎｍｉｄ—ｈｏｓｔｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎＡｂｓｔｒａｃｔＷｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ）ｗａｓｔｈｅｍｏｓｔｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｓｈｒｉｍｐｖｉｒｕｓｓｏｆａｒ．Ｉｔｈａｄｓｐｒｅａｄａｌｌｏｖｅｒｔｈｅｗｏｒｌｄｓｉｎｃｅｏｃｃｕｒｒｅｄｉｎ１９９２．Ｔｈｉｓｖｉｒｕｓｂｒｏｕｇｈｔｇｒｅａｔｅｃｏｎｏｍｉｃｌｏｓｓｅｓｉｎｗｏｒｌｄｓｈｒｉｍｐｆａｒｍｉｎｇｅｖｅｒｙｙｅａｒａｎｄｈａｓｎｏｔｂｅｅｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｔｉｌｌｔｏｄａｙ．ｉｔｗａｓｃｕｒｒｅｎｔｌｙｔｈｅｍａｉｎｄｉｓｅａｓｅｔｈｒｅａｔｔｏｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅｓｈｒｉｍｐｆａｒｍｉｎｇ．Ｉｎｐａｓｔ１０ｙｅａｒｓ，ｍｕｃｈｗｏｒｋｈａｓｂｅｅｎｄｏｎｅａｂｏｕｔＷＳＳＶｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｍｏｄｅｓａｎｄｓｅｖｅｒａｌｒｏｕｔｅｓｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎｈａｖｅｂｅｅｎｆｏｕｎｄ．Ｔｈｅｓｅｉｎｃｌｕｄｅｎｏｔｏｎｌｙｃａｒｔｉｅｒｓｈｒｉｍｐｌａｒｖａｅ，ｏｔｈｅｒｃｒｕｓｔａｃｅａｎｓ（ｅ．ｇ．，ｃｒａｂｓ）ａｎｄｐｌａｎｋｔｏｎｉｎａｎｄａｒｏｕｎｄｃｕｌｔｕｒｅｐｏｎｄｓ，ｂｕｔａｌｓｏｂｉｒｄｆｅｃｅｓ．ＳｈｒｉｍｐｆａｒｍｅｒｓｈａｖｅｔａｋｅｎｃａｒｅｔｏｃｕｌｔｕｒｅＷＳＳＶ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ（ｅ．ｇ．，Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ），ｔｏｂｒｅｅｄＷＳＳＶ－ｆｒｅｅｐｏｓｔｌａｒｖａｅ，ｔｏｒｅｓｔｒｉｃｔｌｉｖｅｆｏｏｄｉｎｐｕｔｓ，ｔｏｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｎｌｅｔｗａｔｅｒｉｎｏｒｄｅｒｔｏｌｉｍｉｔｈｏｒｉｚｏｎｔａｌａｎｄｖｅｒｔｉｃａｌｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆＷＳＳＶＤｅｓｐｉｔｅｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｍｅａｓｕｒｅｓｔｏｒｅｄｕｃｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，ｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆＷＳＳＶｏｕｔｂｒｅａｋｓｗａｓｓｔｉｌｌｖｅｒｙｈｉｇｈｉｎｍａｉｎｌａｎｄＣｈｉｎａ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｉｎｍｏｒｅｎｏｒｔｈｅｍｌｙｒｅｇｉｏｎｓ．Ｔｈｉｓｍａｙｂｅｄｕｅｔｏｔｈｅｆａｃｔｔｈａｔｓｏｍｅｍａｊｏｒｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｒｏｕｔｅｓｈａｖｅｎｏｔｙｅｔｂｅｅｎｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ．ＷＳＳＶｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｉｎｓｈｒｉｍｐｐｏｎｄｓｙｓｔｅｍｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｓｈｒｉｍｐｆａｒｍｉｎｇｐｒａｃｔｉｃｅｂｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｃｒｅｄｉａｂｌｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．ＥｆｆｅｃｔａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｒｏｔｉｆｅｒｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓｉｎｓｈｒｉｍｐｐｏｎｄｓｅｄｉｍｅｎｔｓｉｎｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇＷＳＳＶｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｐｒｉｍａｒｉｌｙ．ＴｈｅｓｅｓｔｕｄｙｃｏｕｌｄｏｆｆｅｒｔｈｅｏｒｙｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｔｏｐｒｅｖｅｎｔＷＳＳＶｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｓｔｕｄｙｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：Ｔｗｏｐａｉｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｆｏｒｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｏｕｔｅｒｏｎｅｗａｓｆｏｒｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰｅＲ），ｔｈｅｉｎｎｅｒｏｎｅｗａｓｆｏｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐｒｏｂｅ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆｏｕｔｅｒｐｒｉｍｅｒｓＰｅＲ—ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｉｓｉｓｗａｓｌｐｇＷＳＳＶＤＮＡ，ｗｈｉｃｈｗａｓ】０ｆｇＷＳＳＶＤＮＡｉｎＰｅＲ—ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＳｉｎｇｌｅｉｎｎｅｒｐｒｉｍｅｒｓｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｃｏｕｌｄｏｎｌｙｄｅｔｅｃｔｍｏｒｅｔｈａｎｌｎｇＷＳＳＶＤＮＡ．ＴｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆＰｅＲ—ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗａｓ１０２ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎＰｅＲ—ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｉｓｉｓ，１０’ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｓｉｎｇｌｅｄｏｔｂｌｏｔ４

皂壁堡垒生堕童！！兰里塑兰！丝型墨竺垡垡墨堡塑垫塑±塑塑圭塑塑奎型！壅：ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．ＴｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆＰＣＲ—ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＳｏｕｔｈｅｒｎｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＰＣＲ—ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗａｓｓｕｉｔｆｏｒｔｒａｃｅＷＳＳＶｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｕｒａｃｉｌ·ＤＮＡｇｌｙｃｏｌｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）ｗａｓｕｓｅｄｔＯｃｏｎｔｒｏｌｃａｒｒｙ—ｏｖｅｒｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｉｎＷＳＳＶＤＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎｂｙＰＣＲ．ＯｐｔｉｍａｌｄＵＴＰａｎｄＭｇ：＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｉｓｐａｉｒｏｆｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅＯ．４ｒａＭａｎｄ２．ＯｍＭｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｗｈｅｎＵＮＧＷｒｉｔｓｐｒｅｓｅｎｔ．ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆＷＳＳＶＤＮＡｂｙＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＷａＳｌｐｇｏｎｔｈｉｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．ＵＮＧｍａｄｅｔｈｉｓＰＣＲｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｄｅｇｒａｄｅｏｎｅ—ｔｅｎｔｈ．Ａｔｌｅａｓｔ１０ｎｇＷＳＳＶＤＮＡｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｄＵｃｏｕｌｄｂｅａｂｏｌｉｓｈｅｄｂｙＯ．５ＵＵＮＧｐｒｉｏｒｔｏｔｈｅｎｏｒｍａｌＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＴｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｗａｓｏｃｕｒｒｅｄｉｎＷＳＳＶｉｎｊｅｃｔｅｄＣａｍｂａｒｕｓｐｒｏｃｌａｒｋｉｉｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈＰＣＲ．Ｂｕｔ．ｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｏｃｃｕｒｒｅｄｗｈｅｎｔｈｅＤＮＡｓａｍｐｌｅｗａｓｄｉｌｕｔｅｄｔｏ１０—１００ｔｉｍｅｓ．ＴｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＤＮＡｐｒｏｂｅｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｓｅｃｔｉｏｎ，ＰＣＲｆａｌｓｅｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｃｏｕｌｄｂｅｃｏｎｃｌｕｄｅｄ．Ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｐｒｉｍｅｒｔｏｔｅｍｐｌａｔｅｆｏｒｓｃｃｅｓｓｆｕｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗａｓ２．４３ｘ１０’一２．４３ｘ１０１０；ＴｈｅｒｅａｓｏｎａｎｄｐｒｅｖｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒＰＣＲｆａｌｓｅｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．Ｉｎ２００２，ｍｏｒｅｔｈａｎ１０００ｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＰＣＲ－ＤＮＡｐｒｏｂｅｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ｗｓｓｖ）ｃａｒｒｙｉｎｇｓｔａｔｕｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ２６．６％ｗａｓＷＳＳＶｐｏｓｉｔｉｖｅｉｎ６３９ｓｈｒｉｍｐｓａｍｐｌｅｓ．１８，２％ｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｉｎ７７ｃｒａｂｓａｍｐｌｅｓ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅＷＳＳＶｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｉｏｗａｓ３８．３％ｉｎ２６６ｚｏｏｐｌａｎｋｔｏｎｓａｍｐｌｅｓ，ａｎｄｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｉｏＷａｓｄｅｃｌｉｎｅｄｆｒｏｍＭａｒｃｈｔｏＳｅｐｔｅｍｂｅｒ．Ｎｏｔｉｃｅａｂｌｅ，ｔｈｅｚｏｏｐｌａｎｋｔｏｎｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｉｏｗａｓｓｔｉｌｌｖｅｒｙｈｉｇｈａｆｔｅｒｗａｔｅｒｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ａｌｌｔｈｅ３０ｓｎａｉｌａｎｄｓｈｅｌｌｆｉｓｈｓａｍｐｌｅｓａｎｄ２２ｆｉｌｔｅｒｅｄｓｅａｗａｔｅｒｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅＷＳＳＶｎｅｇａｔｉｖｅ，ＴｈｅＷＳＳＶｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｉｏｗａｓ１７．６％ｉｎ２０４ｍｕｄｓａｍｐｌｅｓ．Ｉｎ２００２，ｔｗｏｐｅｎ—ｃｌｏｓｉｎｇｃｕｌｔｕｒｉｎｇｐａＵｅｒｎｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｃｕｌｔｕｒｅＦｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｓｉｓａｎｄＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉｉｎＲｕｓｈａｎｓｈｒｉｍｐｆａｒｍ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＷＳＳＶｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｉｏｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎＦｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｓｉｓｃｕｌｔｕｒｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ，ａｎｄｉｔｗａｓｖｅｒｙｈｉｇｈｉｎｚｏｏｐｌａｎｋｔｏｎ．ＴｈｅＷＳＳＶｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｉｏＷａｓｄｅｃｌｉｎｅｄｉｎＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉｃｕｌｔｕｒｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ，ａｎｄｉｔｗａｓｖｅｒｙｌｏｗｉｎｚｏｏｐｌａｎｋｔｏｎ．Ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｏｆｆａｂｒｉｃｐｅｎ·ｃｌｏｓｉｎｇｗａｓｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｎｅｔ５

白斑综台症病毒（ｗｓｓｖ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究ｐｅｎ—ｃｌｏｓｉｎｇ．Ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ）ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＰＣＲ—ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｉｎｒｏｔｉｆｅｒｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓｆｒｏｍｓｈｒｉｍｐｃｕｌｔｕｒｅｐｏｎｄｓｅｄｉｍｅｎｔｓ．Ｉｔｗａｓａｌｓｏｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｒｏｔｉｆｅｒｓｈａｔｃｈｅｄｆｒｏｍｔｈｏｓｅｅｇｇｓ．ＳｕｒｆａｃｅｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｂｅｆｏｒｅａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＷＳＳＶｗａｓｐｒｏｂａｂｌｙｐｒｅｓｅｎｔｗｉｔｈｉｎｔｈｅｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓ．ＲｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｒｏｔｉｆｅｒｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓｍａｙｂｅａｌｌｏｖｅｒｗｉｎｔｅｒｉｎｇｒｅｓｅｒｖｏｉｒｆｏｒＷＳＳＶｉｎｓｈｒｉｍｐｐｏｎｄｓ．Ｂｒａｃｈｉｏｎｕｓｕｒａｅｕｓｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｓｅａｗａｔｅｒｐｏｎｄｓａｎｄｈａｔｃｈｅｄｒｏｔｉｆｅｒｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｂｙｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｌｌａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｄｉｓｔｉｎｃｔ，ｉｒｒｅｇｕｌａｒｐｌｅａｔｐｒｏｍｉｎｅｎｃｙａｎｄｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｏｆｔｈｅｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇ．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｄｅｎｓｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎｓａｎｄｍｉｔｏｅｈｏｎｄｒｉｏｎｓｉｎｒｏｔｉｆｅｒｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｒｏｔｉｆｅｒｎｕｃｌｅｕｓａｎｄｎｕｃｌｅｏｌｕｓｗｅｒｅｉｎｆｌａｔｅｄａｆｔｅｒｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｅｓ（ｗｓｓｖ）ｓｏａｋｉｎｇ．Ｔｈｅｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｓｈｒｉｍｐｐｏｎｄｒｏｔｉｆｅｒｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓａｎｄｈａｔｃｈｅｄｒｏｆｉｆｅｒｓｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ｗｓｓｖ）ｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｐｒｉｍａｒｉｌｙ．ＴｈｅＰｒｏｃａｍｂａｒｕｓｃｌａｒｋｉｉｗａｓｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｌｌｒｏｔｉｆｅｒａｎｄｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｉｎｏｃｕｌｕｍ．ＮｏｎｅＰｒｏｃａｍｂａｒｕｓｃｌａｒｋｉｉｗａｓＷＳＳＶｐｏｓｉｔｉｖｅｉｎｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｉｎｏｃｕｌｕｍｉｎｊｅｃｔｅｄｇｒｏｕｐ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｏｎｅｗａｓＷＳＳＶｐｏｓｉｔｉｖｅｉｎｒｏｔｉｆｅｒｉｎｏｃｕｌｕｍｉｎｊｅｃｔｅｄｇｒｏｕｐ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｏｔｉｆｅｒｍａｙｂｅｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇＷＳＳＶ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ；ＰＣＲ－ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ｐｅｎ—ｃｌｏｓｉｎｇｃｕｌｔｕｒｉｎｇｐａｔｔｅｒｎｓ；ｒｏｔｉｆｅｒｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓ；ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｒｏｕｔｅ６

白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰｃＲ检测条件优化及浮游动物中问宿主的调查研究弟一早第一章文献综述Ｃｈａｐｔｅｒ义陬猕怂１Ｒｅｖｉｅｗ７

自斑综台症病毒（ｗｓｓｖ）的ＰｃＲ检测条件优化及浮游动物中阐宿主的调蔷研究（一）对虾白斑综合症（ｗｓｓ）研究进展Ｒｅｖｉｅｗ０１１ＳｈｒｉｍｐＷｈｉｔｅＳｐｏｔＳｙｎｄｒｏｍｅ摘要：对虾白斑综合症（ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＷＳＳ）自１９９２年暴发以来，已在世界范围内传播开来，每年给对虾养殖业造成巨大经济损失，至今仍未得到完全控制。本文根据１９９５—２００３年的有关文献资料，综述了对虾自斑综合症的症状、病原、宿主、传播途径、检测技术及防治措施方面的研究进展。关键词：对虾：白斑综合症；白斑综合症病毒Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｈｒｉｍｐｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＷＳＳ）ｗａｓｆｉｒｓｔｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎ１９９２ａｎｄｈａｓｓｐｒｅａｄａｌｌｏｖｅｒｔｈｅｗｏｒｌｄ．ＴｈｉｓｅｐｉｄｅｍｉｃｂｒｏｕｇｈｔｇｒｅａｔｅｃｏｎｏｍｉｃｌｏｓｓｅｓｉｎｗｏｒｌｄｓｈｒｉｍｐｆａｒｍｉｎｇｅｖｅｒｙｙｅａｒａｎｄｈａｓｎｏｔｂｅｅｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｔｉＩＪｔｏｄａｙ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｓｙｍｐｔｏｍ．ｐａｔｈｏｇｅｎｙ，ｈｏｓｔ，ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｒｏｕｔｅｓ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｉＲｎｉｑｕｅｓ，础ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆＷＳＳｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｏｆｌ９９５—２００３．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｅｎ∞ｕｓｓｈｒｉｍｐ；ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅ（ｗｓｓ）；ｗｈｉｍｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ）对虾白斑综合症（ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＷＳＳ）于１９９２年首次发现于台湾（Ｃｈｏｕｅｌａｌ，１９９５），１９９３年５—８月在我国大陆沿海从南到北的养殖场暴发（黄健等，１９９５），与此同时，日本等亚洲国家的对虾养殖场也暴发了此病。目前，在亚洲已报道的对虾白斑综合症的流行国家和地区包括台湾、中国大陆、朝鲜、泰国、韩国、印度尼西亚、越南、马来西亚、印度、斯里兰卡、盂加拉国等（Ｌｉｇｈｔｎｅｒｅｔａｌ，１９９９）。１９９５年，美国德克萨斯州对虾养殖场出现白斑综合症，并在西半球的其它地方相继暴发。至此，白斑综合症在世界范围内传播开来，每年给对虾养殖业造成几百亿元的经济损失，成为对虾养殖业可持续发展的严重障碍。１９９５年，国际兽疫局（ＯＩＥ）、联合国粮农组织（ＦＡＯ）以及亚太地区水产养殖发展网络中心（ＮＡＣＡ）将其列为需要报告的水生动物病毒性疫病之一（雷质文等，２００２）。本文根据１９９５－－２００３年的有关文献资料，综述了对虾白８

白斑综台症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ检测条件优化投浮游动物中间宿主的调查研究斑综合症的研究进展。１白斑综合症的外观症状和病理变化１．１总体症状症状患病对虾最初表现为离群孤游，间断地浮上水面，不吃食；随着时间的推移，发病对虾虾体明显虚弱，静卧池底，胃肠完全空虚，头胸甲及腹节甲壳易剥离，头胸甲内面有明显的白斑；发病后期，濒死对虾对外界反应迟钝，虾体发红，腹节肌肉略微泛白，肝胰腺颜色变淡，对虾死亡迅速增加（黄健等，１９９５）。印度明对虾（Ｆｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅｕｓｉｎｄｉｃｕｓ）在注射白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）２４ｈ后出现嗜睡和厌食症状，３６ｈ后出现红体，４８ｈ后出现白斑（Ｙｏｇａｎａｎｄｈａｎｅｔａｌ，２００３）。Ｓｕｄａｎ等（１９９８）将白斑综合症的暴发分为三种形式，即（１）超急型ｆｐｅｒａｅｕｔｅ）：感染对虾大量变红，白斑症少于５％，表面健康个体少于１０％，组织感染程度很高（大于８０％），２－－３ｄ内出现大量死亡；（２）急型至亚急型（ａｃｕｔｅｔｏｓｕｂａｃｕｔｅ）：主要症状是被感染虾头胸甲上有明显的白斑，组织受感染程度２０％一舳％，严重死亡出现在７一ｌＯｄ；（３）慢型（ｃｈｒｏｎｉｃ）：虾体不出现白斑和变红症状，组织感染程度较轻（小于２０％），１５－－２８ｄ内出现死亡。超急型在仔虾中较普遍，急至亚急型和慢型在成体中较常见。白斑的成分及形成一般认为白斑综合症的典型症状是头胸甲内侧出现白斑。Ｗａｎｇｅｔａｌ（１９９７）通过扫描电镜在患白斑综合症的对虾头胸甲内侧观察到两种规格的白斑：大的呈圆顶状，直径０．３—３ｍｍ，位于表皮内表面；小的用肉眼很难看见，直径Ｏ．０２．０．１ｍｍ，象表皮表面的连接突起（１ｉｎｋｅｄｓｐｈｅｒｅｓ）。经能量分散分光计鉴定，白斑的成分组成与表皮相同，主要是钙（８０％－－９０％），且白斑在ＷＳＳＶ的ＰＣＲ检测中呈阳性。白斑形成的真正原因目前尚不清楚。黄健等（１９９５）认为白斑是甲壳质的不正常分泌所造成不规则排列形成花朵样小斑而使光线发生散射所致，且自斑出现的机率随体长的增加而增大。Ｗａｎｇｅｌａｌ（１９９９）发现感染ＷＳＳＶ的对虾表皮下有许多大的空泡和细胞碎片，并且这些空泡的大小和形状与白斑一致，因此他们推测白斑的形成与空泡和细胞退化有９

白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中问宿主的调查研究关。Ｃｈａｎｇｅｌａｌ（１９９８）发现，在感染的对虾中，很容易看到白斑，而在外骨骼较厚的蟹和龙虾中，除非表皮被严重感染病毒，一般很难看到白斑。白斑感染程度较轻时，同样厚度的外骨骼就看不到白斑，白斑的产生需要表皮被严重感染。另外，Ｗａｎｇｅｌａｔ（２０００）发现细菌病在斑节对虾（Ｐｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ）的头胸甲也能引起白斑。鉴于以上原因，白斑的有无并不能作为白斑综合症的诊断标准。１．２病理变化感染组织及器官组织病理学研究结果表明，患白斑综合症的对虾外胚层和中胚层起源的组织细胞表现出细胞退化及严重的细胞核肿大。黄健等（１９９５１在患病对虾的前肠上皮、后肠上皮、真皮、造血组织、结缔组织、鳃组织、触角腺、血细胞等细胞核内均发现有典型的核肿大和深染病变，其中前肠上皮、后肠上皮、真皮、鳃等组织中病变细胞所占比例最大，达６０％．９０％，造血组织病变率通常在４０％一７０％，触角腺细胞的病变率通常在５％．２０％；患病对虾的肝胰腺（中肠腺）、中肠上皮、卵巢或精巢、肌肉等组织的细胞核中未见病变现象。Ｎｕｎａｎｅｔａｌ（１９９７）的原位杂交结果与黄健等的光镜组织病理学检查结果～致。战文斌等（１９９９）研究表明，日本事囊对虾（Ｍａｒｓｕｐｅｎａｅｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）鳃、皮下组织、心脏、淋巴器官、中肠等均可被感染，其中鳃、皮下组织和血窦中感染强度最高，但肝胰腺中没有观察到病毒感染的阳性细胞。ＷＳＳＶ能引起印度明对虾（Ｆｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅｕｓｉｎｄｕｃｕｓ）ｆｆｎ细胞数减少，氧合血蓝蛋白和耗氧量明显降低，这表明虾的呼吸系统己出现机能障碍并引起组织低氧，血蓝蛋白的氧亲合力降低，导致虾因缺氧而死亡（Ｙｏｇａｎａｎｄｈａｎｅｌａｔ，２００３）。另有研究表明，ＷＳＳＶ能感染对虾的Ｙ－器官，导致其细胞解体（ｖｉｉａｙａｎｅｌａｔ，２００３）。因Ｙ－器官分泌的蜕皮激素能调节甲壳动物的生长和繁殖，因此由ＷＳＳＶ引起的Ｙ．器官病变必将导致对虾生长、繁殖等机能障碍。不感染肝胰腺的证据及原因多数研究认为ＷＳＳＶ不感染对虾肝胰腺或只能轻度感染。Ｙｇａｎａｎｄｈａｎｅｌａｔ（２００３）通过组织学观察在感染ＷＳＳＶ的虾肝胰腺中未见组织异常：Ｃｈａｎｇｅｌａｌ（１９９６）应用原位杂交在对虾肝胰腺中发现了ＷＳＳＶ阳性，但ＷＳＳＶ主要局限于肝胰腺鞘的结缔组织和肌上皮细胞，小管上皮上无。１０

白斑综台症病毒（ＷＳＳＶ）的ｐｃＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究Ｙｏｇａｎａｎｄｈａｎｅｔａｌ（２００３）研究了ＷＳＳＶ在印度明对虾的血淋巴、肝胰腺、肌肉内引起的生化和血液学变化，发现ＷＳＳＶ感染引起印度明对虾血淋巴中的总蛋白、氨基酸、糖等指标升高，而肌肉和肝胰腺中的上述指标降低。以上指标直接或问接与病毒感染、机体受胁迫等因素有关，这一结果又从一个侧面证实了ＷＳＳＶ不感染对虾肌肉和肝胰腺。ＷＳＳＶ不感染对虾肝胰腺上皮和中肠上皮，可能因为对虾肝胰腺分泌较多的酸性消化酶及消化液（ｄｉｇｅｓｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｓａｎｄｄｉｇｅｓｔｉｖｅｊｕｉｃｅｓｉｎｌｏｗｐＨ），它们能影响肝胰腺上皮和中肠上皮的静电作用，导致病毒不能感染（Ｗａｎｇｅｌａｌ，１９９９）。感染顺序黄健等（１９９５）发现发病初期的对虾，只在前肠上皮组织中偶尔找到病变的细胞核，因此前肠上皮可能是最先被病毒感染的组织。战文斌等（１９９９１采用整体冰冻切片、单克隆抗体的荧光抗体方法，原位观察了白斑症病毒在日本囊对虾体内的感染增殖，发现ＷＳＳＶ的感染顺序依次为鳃丝腔内的血细胞一血窦、鳃上皮组织、皮下组织一心脏、胃上皮组织一淋巴器官、中肠，鳃、皮下组织和血窦中感染强度最高。Ｃｈａｎｇｅｔａｌ（１９９８）也发现，在一些甲壳类实验中，尽管饲喂严重感染ＷＳＳＶ的组织，鳃感染ＷＳＳＶ的程度远比胃严重，原因仍不清楚。因此，鳃作为ＷＳＳ诊断的主要检测组织不仅结果可靠，而且取材方便。Ｙｏｇａｎａｎｄｈａｎｅｔａｌ（２００３）研究表明，ＷＳＳＶ也能感染对虾的眼柄，因此可考虑将眼柄作为实验材料，这种取材不会将对虾致死。２病原２．１病原的命名和分类地位白斑综合症的病原为一种无包涵体杆状病毒。因不同学者研究方法及侧重点不同，白斑综合症病原被冠以不同的名称：中国大陆的皮下及造血组织坏死杆状病毒（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａｌａｎｄｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，ＨＨＮＢＶ）（黄健等，１９９５）、台湾的白斑杆状病毒（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｗｈｉｔｅ—ｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅ．ＷＳＢＶ）（Ｗａｎｇｅ／ａ／，１９９５）、日本的对虾杆状细胞核病毒（Ｐｅｎａｅｉｄｒｏｄ－ｓｈａｐｅｄＤＮＡｖｉｒｕｓ，ＰＲＤＶ）（Ｉｎｏｕｙｅｅｌａｌ，１９９６）、泰国的系统性外胚层和中胚层杆状病

白斑综台症病毒（ｗｓｓｖ）的ＰｃＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究毒（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｅｃｔｏｄｅｒｍａｌａｎｄｍｅｓｏｄｅｒｍａｌｂａｃｕｌｏｖｉｒｓ，ＳＥＭＢＶ）（Ｗｏｎｇｔｅｅｒａｓｕｐａｙａｅｌａｌ，１９９５）等。这些病毒的形态学、组织病理学特征及ＤＮＡ序列非常相近。Ｋａｓｏｍｃｈａｎｄｒａｅｔａｌ（１９９８）用从泰国病虾中分离出的ＷＳＳＶ的ＤＮＡ片断的一部分序列作为引物，以其它５个国家病虾中分离出的病毒ＤＮＡ作模板进行ＰＣＲ扩增，结果均能扩增出大致相同的产物。Ｗａｎｇｅｔａｌ（１９９９）用来自６个国家和地区的患病虾中的病毒做感染实验，发现它们的毒性差异很小。因此不同国家的白斑综合症均由品系相近的病毒引起，可认为是同一种病毒的不同分离株。Ｌｉ【ｇｈｔｎｅｒ（１９９６）汇集了所有这些无包涵体病毒，统称为白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ，ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ）。根据白斑综合症病毒的形态、大小及聚集位置，多数研究者认为其属于杆状病毒科、裸杆状病毒亚科、无包涵体杆状病毒属（Ｋａｓｏｍｃｈａｎｄｍｅｔａｌ，１９９８：Ｌｉｇｈｔｎｅｒ，１９９６）。１９９５年，国际分类委员会（ＩＣＴＶ）第６次报告取消了杆状病毒科的亚科分类阶元，杆状病毒科只包括核型多角体病毒属（Ｎｅｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）和颗粒病毒属（Ｇｒａｎｕｌｏｖｉｒｕｓ）ｆ徐耀先等，１９９９），这样，ｗｓｓｖ就不再属于杆状病毒科。目前，多数研究认为其是一种新病毒，如Ｙａｎｇｅｔａｌ（２００１）及ＶａｎＨｕｔｅｎｅｌａｌ（２００１）将ＷＳＳＶ的全序列与ＧｅｎｅＢａｎｋ上其它ＤＮＡ序列比较，发现它不同于以往的任何一种病毒，其开放阅读框编码的蛋白与其它己知蛋白也没有任何同源性，这是ＷＳＳＶ为～种新病毒的强有力的证据。Ｌｉｕｅｔａｌ（２００１）研究了编码蛋白激酶的ＷＳＳＶ基因的克隆和系统分析，表明ＷＳＳＶ蛋白激酶与己知蛋白激酶无任何亲缘关系。Ｃｈｅｎｅｔａｌ（２００２）通过ＷＳＳＶ的ＤＮＡ聚合基因（ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＧｅｎｅ）的转录分析，证明ＷＳＳＶ是一种新病毒，且可能属于一新科。ＶａｎＨｕｌｔｅｎｅｔａｌ（２００１）认为ＷＳＳＶ属于一个新病毒属（胛，ｉｓｐｏｖｉｒｕｓ）或属于～个新病毒科（建议为Ｗｈｉｓｐｏｖｉｒｉｄａｅ）。２－２病原彩态结构ＷＳＳＶ为一种无包涵体杆状病毒，外被囊膜，其核酸为双链ＤＮＡ，这一点已为国内外虾病工作者所公认。但因地域、宿主、实验条件等不同，不同学者报道的ＷＳＳＶ结构及大小又稍有差异。黄健等（】９９５）用烟草花叶病毒（ＴＭＶ）１２

白斑综台症病毒（ｗｓｓｖ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究作为内标定物测得ＷＳＳＶ大小为１５０ｎｍ×４５０ｈｍ。病毒粒子横切面为杆状而略带椭圆，粒子外被囊膜，囊膜为双层结构，囊膜内可见杆状的核衣壳和核衣壳内致密的髓核。病毒的衣壳结构为螺旋圆柱体形，大小约为９５ｒｉｍ×４５０ｎｍ，螺旋带几乎与衣壳长轴垂直，螺距为３０ｎｍ，每匝螺旋宽２６ｒｉｍ，螺旋问距４ｒｉｍ。该螺旋衣壳由两条并行的约９ｒｉｍ宽的螺旋，中间夹一条宽约８ｒｉｍ的中间带组成。每个子粒单位由两个边缘颗粒和一个中间颗粒组成，呈“ｃ”形结构，子粒排列周期约为１４ｎｍ。在衣壳的两端为一对梯形的帽状结构，帽状结构之间有１３圈衣壳螺旋。Ｋａｓｏｍｃｈａｎｄｒａｅｔａｌ（１９９８）比较了来自亚洲６个国家的ＷＳＳ病虾组织，确定病原为（７０一１２０）ＩⅡｎ×（２４０－－３４０）ｎｍ大小不等、形状相似的杆状、椭圆形病毒粒子，外被三层囊膜。Ｗａｎｇｅｌａｌ（１９９７）报道毒粒在斑节对虾中大小为（２９８＋２１）ｎｍ×（１０７＿８）ｎｍ，在日本囊对虾中（２４８＋１２）ｒｕｎ×（１０４＋８）ｎｍ。Ｗａｎｇｅｔａｌｆｌ９９９）报道ＷＳＳＶ在斑节对虾中大小为（３０５：１：３０）×（１２７ａ：１１）ｎｍ。２．３病原的多肽及基因组黄健等（１９９５）报道ＷＳＳＶ囊膜有１２种主要多肽，可分为６个主带区，分别为８０ｋｄ以上（２条）、６３ｋｄ（１条）、５０—５１ｋｄ（２条）、４２ｋｄ（１条）、３０－３３ｋｄ（３条）、１７．８ｋｄ以下（３条），在主带区之间，还存在一些较弱的区带，共可读出约２３条区带。在病毒衣壳和完整粒子中都存在的２３．４和１９ｋｄ多肽是病毒衣壳的组分，而其它多肽是病毒囊膜的成分。Ｎａｄｌａｅｌａｌ（１９９８）报道在１８－２８ｋＤａ之间有３种主要多肽：１９ｋＤａ，２３．５ｋＤａ，２７．５ｋＤａ，其中１９ｋＤａ和２７．５ｋＤａ是囊膜的成分。ＶａｎＨｕｌｔｅｎｅｔａｌ（２０００）在完整ＷＳＳＶ病毒粒子的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ中发现４种主要多肽：１９ｋＤａ（ＶＰｌ９），２４ｋＤａ（ＶＰ２４），２６ｋＤａ（ＶＰ２６），２８ｋＤａ（ＶＰ２８），其中ＶＰ２４和ＶＰ２６是核衣壳的主要组分，ＶＰｌ９和ＶＰ２８是囊膜的成分，这与Ｎａｄｌａ（１９９８）的报道基本相同。ｖａｉｌＨｕｈｅｎｅｔａｌ（２００１）用ＶＰ２８抗血清体外中合后的ＷＳＳＶ注射入斑节对虾体内，虾无发病死亡，而未经ＶＰ２８抗血清体外中合的ＷＳＳＶ注射入对虾体内后引起１００％死亡，这表明囊膜上的ＶＰ２８与ＷＳＳＶ在虾体内的系统感染有关。关于ＷＳＳＶ基因组大小的报道差别较大，黄健等（１９９５）报道约为３５ｘ１０６

白斑综台症病毒（ｗｓｓｖ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究ｄ（约３４０ｋｂ），Ｗｏｎｇｔｅｅｍｓｕｐａｙ（１９９５）报道为１６８ｋｂ，Ｗａｎｇｅｔａｌ（１９９５）报道为１５０ｋｂ以上，Ｎａｄａｌａｆ１９９８）报道为１８３ｋｂ以上。２００１年，我国科学家Ｙａｎｇｅｔａｌ报道ＷＳＳＶ全序列３０５１０７ｂｐ，含有１８１个开放阅读框（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｓ，ＯＲＦｓ）。同年，荷兰科学家ＶａｌｌＨｕｌｔｅｎｅｔａｌ报道ＷＳＳＶ基因组ＤＮＡ全序列２９２９６７ｋｂ，含有１８４个开放阅读框。随着ＷＳＳＶ全基因组序列的确定，有关ＷＳＳＶ功能基因及功能蛋白的研究成为新的热点。２．４环境因子及理化因子对病原感染力的影响在各环境因子中，温度对ＷＳＳＶ感染力影响最明显，温度过高或过低都会降低ＷＳＳＶ的活力。Ｇｕａｎｅｌａｌ（２００３）研究了温度对日本囊对虾感染ＷＳＳＶ的影响，实验设１５、２３、２８、３３。Ｃ四个温度，结果表明２８０Ｃ时虾感染ＷＳＳＶ最严重，血细胞总数最少，１５。Ｃ时感染最轻，血细胞总数娥多，３３０Ｃ时次之。这说明ＷＳＳＶ在２８。ｃ时感染力已很弱，在１５。Ｃ时和３３。Ｃ时感染力已很弱。水体理化因子诸因素中，以氨氮的影响最显著，氨氮含量升高可明显地提高ＷＳＳＶ的感染强度（何建国等，１９９９）。Ｗａｎｇｅｌａｌ（１９９７）研究了不同氨浓度下ＷＳＳＶ对日本囊对虾的感染情况：（１）将虾浸在含ＷＳＳＶ的ＰＢＳ中，加２ｐｐｍ的氨；（２）虾浸在含等量ＷＳＳＶ的ＰＢＳ中，不加氨；（３）虾浸在ＰＢＳ中，作为阴性对照。结果，第一种情况１４天对虾累计死亡４０＊．４，（２）、（３）两种情况未发现症状。这一实验结果说明氨能提高ＷＳＳＶ对养殖虾的感染程度。谢数涛等（２０００）研究了几种理化因子对ＷＳＳＶ感染力的影响，发现ＷＳＳＶ在３ＭＮａＣＩ溶液中１ｈ失去感染力；在ｐＨ小于５或大于１２．６的条件下失去感染力；对７０℃高温非常敏感，推测７０℃可能是个临界点；Ｔｒｉｔｏｎ一１００，ＮＰ－－４０，Ｃ１２，甲醛等均能使ＷＳＢＶ失活。Ｍｉｎｏｒｕｅｔａｌ（１９９８）研究了几种处理对ＷＳＳＶ的影响，发现ｌｐｐｍ次氯酸钠作用３０ｍｉｎ或５ｐｐｍ作用１０ｍｉｎ可使ＰＲＤＶ失活，１０ｐｐｍ作用３０ｍｉｎ可使ＳＥＭＢＶ失活：高浓度ＮａＣＩ（１２．５％）２５。Ｃ作用２４ｈ可使ＰＲＤＶ失活，１５％ＮａＣＩ于２８。Ｃ作用２４ｈ可使ＳＥＭＢＶ失活；５００ｃ加热２０ｍｉｎ，３００Ｃ干燥或乙醚处理均能使ＰＲＤＶ失活。黄健等（１９９５）发现ＷＳＳＶ对乙醚和５６＂Ｃ３０ｍｉｎ处理敏感。可见，离开对虾组织的ＷＳＳＶ具有一定的存活力，但与形成１４

自斑综合症病毒（ｗｓｓｖ）的ＰＥＲ检测条件优化及浮游动物中问宿主的调查研究包涵体的对虾杆状病毒相比，其存活能力并不强，极易失去感染活性，普通的去污剂或蛋白变性剂均能灭活ＷＳＳＶ。这提示ＷＳＳＶ在养虾池塘或自然海域中不以离体传播为主要方式，ＷＳＳＶ几年来如此猖獗，令养殖者防不胜防，更与其广泛的宿主有关。３宿主３．１绝大多数虾、蟹类是ＷＳＳＶ的宿主ＷＳＳＶ的宿主种类很多，已发现和确定的有近４０种。世界上所有的人工养殖对虾种类、大部分蟹类、野生虾类都是ＷＳＳＶ的宿主。根据感染病原后的表现，ＷＳＳＶ的宿主可分为两类：敏感载体（ａｃｕｔｅｃａｒｒｉｅｒｓ）和可能载体（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｃａｒｒｉｅｒｓ）。Ｗａｎｇｅｔａｌ（１９９８）通过ＰＣＲ方法在台湾的４种主要养殖对虾斑节对虾∽ｍｏｎｏｄｏｎ）、日本囊对虾（Ｍａｒｓｕｐｅｎａｅｕｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、长毛明对虾（Ｆｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅｕｓｐｅｎｉｃｉｌｌａｔｕｓ）、刀颧新对虾（Ｍｅｔａｐｅｎａｅｕｓｅｎｓｉｓ）及野生短钩对虾Ｐ．ｓｅｍｉｓｕｌｅａｔｕｓ中均检出ＷＳＳＶ阳性，它们是ＷＳＳＶ的敏感载体。在野生虾Ｅｘｏｐａｌａｅｍｅｎｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｔｒａｃｈｙｅｎａｅｕｓｃｕｖｉｒｏｓｔｒｉｓ、Ｍｅｎｓｉｓ、沼虾ＭａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍＳｐ、克氏原螯虾Ｐｒｏｃａｍｂａｒｕｓｃｌａｒｋｉｉ，野生蟹子Ｃａｌａｐｐａｌｏｐｈｏｓ、Ｐｏｒｔｕｎｕｓｓａｎｇｕｉｎｏｔｅｎｔｕｓ、Ｃｈａｒｙｂｄｉｓｇｒａｎｕｌａｔａ、Ｃｆｅｒｉａｔａ和野生龙虾Ｐａｎｕｌｉｒｕｓｏｒｎａｔｕｓ、Ｐｌｏｎｇｉｐｅｓ、Ｐ．ｐｅｎｉｃｉｌｌａｔｕｓ中未检出阳性，但它们可被ＷＳＳＶ感染，且许多被感染个体不引起疾病症状，这些野生蟹子和龙虾是ＷＳＳＶ的可能载体。Ｒａｊｅｎｄｒａｎｅｔａｌ（１９９９）用ＷＳＳＶ感染了印度的５种对虾、２种淡水对虾、４种蟹及３种龙虾，发现它们均能感染ＷＳＳＶ，并指出蟹、淡水对虾和龙虾是ＷＳＳＶ的无症状携带者。一些野生虾、蟹等ＷＳＳＶ的无症状携带者尽管在水产上不重要，但它们广泛分布于对虾养殖场，它们的可感染性可能在传播ＷＳＳＶ中起着重要作用。雷质文等（２００２）用地高辛（ＤＩＧ）标记的ＷＳＳＶＤＮＡ探针斑点杂交与原位杂交技术，在中国明对虾（Ｆｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、斑节对虾（Ｐｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ）、凡纳滨对虾（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅ０、刀额新对虾（胁，印ｇＭＰ淞ｅｎｓｉｓ）、脊尾白虾（Ｅｘｏｐｌａｅｍｏｎｃａｒｉｎｉｃａｕｄａ）、天津厚蟹（Ｈｅｌｉｃｅｔｒｉｄｅｎｓｔｉｅｎｔｓｉｎｅｎｓｉｓ）、日本大眼蟹１５

白斑综台症病毒（ｗｓｓｖ）ｌ的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究（朋ａｃ唧矗ｆ砌砌埘却ｏ＂耙虾）体内检测到了ＷＳＳＶ，它们是ＷＳＳＶ的天然宿主。在经人工感染的哈氏美人虾（＂Ｃａｌｌｉａｎａｓｓａｈａｒｍａｎｄｉ）、短脊鼓虾似ｌｐｈｅｕｓｂｒｅｖｉｃｒｉｓｔａｕｔｕｓ）、克氏原螯虾（ＰｒｏｃａｍｂｕｒａｓｃｔａｍＯ、肉球近方蟹（Ｈｅｍｉｇｒａｐｓｕｓｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）、藤壶（Ｂａｔａｎｕｓｓｐ．）体内检测到了ＷＳＳＶ，它们是ＷＳＳＶ的潜在宿主。３．２卤虫能否传播岭ｓｖ尚无定论ＳａｈｕｌＨａｍｅｅｄｅｔａｌ（２００２）的研究认为卤虫Ａｒｔｅｍｉａｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ对ＷＳＳＶ具有抗性，ＷＳＳＶ浸泡和投喂均不能使其感染，且经ＷＳＳＶ浸泡和投喂处理的卤虫也不能将病毒传给对虾印度明对虾，因此他们认为卤虫不是ｗＳＳＶ的宿主或携带者。Ｃｈａｎｇｅｌａｌ用套式ＰＣＲ从卤虫卵中测得ＷＳＳＶ阳性，但在孵出的卤虫幼体及投喂卤虫幼体的斑节对虾中却不能检测到ＷＳＳＶ，他们认为可能卤虫卵的外部被ｗｓｓＶ污染，在孵化或幼体冲洗过程中ＷＳＳＶ被去除，但也不排除卤虫卵内部携带ＷＳＳＶ的可能性，这需要进一步的实验证明。３－３浮游动物传播ＷＳＳＶ不容忽视有关ＷＳＳＶ宿主的研究绝大多数局限于养殖对虾及野生虾、蟹等“大型”动物，枝角类、桡足类、轮虫等“小型”浮游动物携带ＷＳＳＶ的情况及在传播ＷＳＳＶ中的作用尚不十分清楚。黄健等（１９９５）用单克隆抗体酶联免疫技术（ＥＬＩＳＡ）检测了浮游生物的带病毒情况，结果桡足类浮游生物的带毒率高于对虾，且其阳性的出现早于对虾，因此推测桡足类可能是对虾暴发性流行病的主要病原携带者。何建国等（１９９９）：通过人工感染和ＰＣＲ方法证明桡足类是ＷＳＳＶ的宿主，而且进～步证明桡足类是ＷＳＳＶ传播的媒介生物之一。雷质文等（２００２）采用ＷＳＳＶＤＮＡ探针斑点杂交与原位杂交技术从发病虾池的桡足类中未测出ＷＳＳＶ阳性，这与其检测方法不够灵敏有关，如采用ＰＣＲ－核酸探针斑点杂交，可能会是另一种结果。Ｙａｈｅｌａｌ《１２００４）用ＰＣＲ方法在虾池底泥的轮虫体眠卵中检测到ＷＳＳＶ阳性，推测虾池中的轮虫休眠卵在隔冬传播ＷＳＳＶ中可能起着重要作用。浮游动物是对虾食物链中的一个重要环节，同时浮游动物在水体中繁殖快、数量大，因此，浮游动物在对虾白斑综合症的暴发流行中１６

白斑综合症病毒（ｗｓｓｖ）的ＰｃＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究可能起着非常重要的作用。浮游动物在传播ＷＳＳＶ中的作用机制尚不清楚，许多问题有待进一步深入研究。到目前为止，多数研究证明鱼类、软体类（如对虾生物饲料贝类）、腔肠动物、海绵动物、环节动物等不是ＷＳＳＶ的敏感宿主，如黄健等（１９９５）测得发病虾池中混养的贝类及海区蓝蛤均为ＷＳＳＶ阴性。４传播途径ＷＳＳＶ的传播途径从组织病理学角度可分为水平传播和垂直传播，其中水平传播的研究已较深入，而垂真传播尚无定论。４．１水平传播经口感染是ＷＳＳＶ感染宿主的主要途径，健康对虾摄食带病毒饵料生物或患白斑综合症的病虾和死虾均能感染上ＷＳＳＶ。多数研究认为，游离在水体中的病毒很难通过体表感染对虾，因为游离ＷＳＳＶ在海水中具有感染活性的时间很短，且游离ＷＳＳＶ不能通过浸浴方式感染健康虾（黄健等，１９９５：何建国等，１９９９；刘萍等，２００１）。对虾摄食携带ＷＳＳＶ的宿主后，所排出的粪便中的ＷＳＳＶ具有活性，受感染的对虾排出的自身破碎组织中也含有活性的ＷＳＳＶ，这部分ＷＳＳＶ理论上讲可以污染对虾饵料经口感染引起ＷＳＳＶ的暴发流行，但实际上，这部分病毒与对虾人工配合饵料混和后投喂对虾，不能引起对虾白斑综合症，这是因为少量的病毒不能引起对虾患自斑综合症，只有ＷＳＳＶ达到一定剂量时才能经口感染引起白斑综合症。因而通过ＷＳＳＶ污染食物和水中游离ＷＳＳＶ经体表感染而引起白斑综合症的可能性很小（何建国等，１９９９）。Ｓｏｔｏｅｆａｌ（２００１）应用数学模型比较研究了ＷＳＳＶ通过投喂和浸泡两种方式对凡纳滨对虾的传播率（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｒａｔｅ），结果ＷＳＳＶ在浸泡感染中的传播率为Ｏ．Ｏｌ，而在投喂ＷＳＳＶ病料中的传播率为Ｏ．４６，这表明浸泡不是一静重要的传播ＷＳＳＶ的途径。Ｍａｅｄａｅｌａｔ（１９９８）研究发现ＷＳＳＶ病毒粗提液在４。Ｃ下可保持活性１２０ｄ以上，２５。Ｃ下可保持活性６０－－１２０ｄ；而稀释１０７倍的ＷＳＳＶ病毒粗提液在４０Ｃ只能１７ｖ

白斑综台症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰｃＲ检测条件优化及浮游动物中问宿主的调查研究保持活性ｌＯｄ，２８０ｃ下只能保持活性５ｄ。这表明ＷＳＳＶ在较低浓度下极易失活，这又从一个侧面证实ＷＳＳＶ经水介质传播的可能性是很小的。从宏观上讲，水平传播可通过陆地、海洋或空气、冷冻食品运输等多种途径进行。Ｎｕｎａｎｅｌａｌｆｌ９９８）通过ＰＣＲ从进口冰冻虾中检出具感染性的ＷＳＳＶ，因此他们猜测１９９５年后在西半球出现的白斑综合症可能是由亚洲进口的冷冻虾中的ＷＳＳＶ引起的。这一事例足以引起我们对进出口检疫的重视。４．２垂直传播ＷＳＳＶ有无垂直传播途径尚未取得肯定的结论。宋晓玲等（１９９６）、包振民等（１９９７）等对中国对虾进行人工感染的研究发现卵母细胞中有大量的病毒粒子，因此推测病毒可通过生殖细胞进行垂直传播。江世贵等（２００３）发现感染ＷＳＳＶ的斑节对虾亲虾能产出携带ＷＳＳＶ的卵子，且这些卵子可发育成部分携带ＷＳＳＶ的幼体。在排除了实验过程中使用的海水、亲虾及幼体饵料携带ＷＳＳＶ的可能性外，仔虾所携带的ＷＳＳＶ应来自其亲虾，这就是说ＷＳＳＶ存在垂直传播。Ｃｈａｎｇｅｌａｌ（１９９８）通过原位杂交在虾和蟹的生殖组织中观察到了ＷＳＳＶＤＮＡ，因此认为垂直传播可能存在。但他们只在生殖组织的结缔组织中发现有ＷＳＳＶＤＮＡ，它能否感染卵母细胞或通过病毒的基因传递给生发细胞仍不清楚，需要进一步研究。刘萍等（１９９９）采用套式ＰＣＲ检测了１０尾亲虾的卵巢，发现２尾虾的卵巢呈阳性，且其所产的卵也里阳性，但跟踪检测幼体时并没有发现阳性结果，说明病毒难以从卵直接向幼体传播。卵的带毒可能是因为亲虾的卵巢代谢旺盛、发育快，病毒感染卵巢组织，进而感染卵母细胞所致。Ｌｏｅｌａｌ（］９９７）认为ＷＳＳＶ不能从亲虾经卵传播给子代，亲虾所携带的ＷＳＳＶ只能释放到水体进而通过水平途径感染发育中的幼体。５诊断技术白斑综合症的诊断技术已相当成熟，常规的组织切片、电镜技术及现代的免疫学、核酸分子生物学技术均已应用于ＷＳＳＶ的检测。１８

自斑综合症病毒（ｗｓｓｙ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究５．】常规组织病理学诊断技术常规组织切片和电子显微镜的方法是最初研究白斑综合症的主要手段，在对ＷＳＳＶ的研究中占有重要位置。通过这种方法可以揭示白斑综合症的病变特征、定位ＷＳＳＶ的复制位置、研究ＷＳＳＶ病毒粒子及核衣壳的形态和结构（黄健等，１９９５；Ｗａｎｇｅｔａｌ，１９９７；Ｗｏｎｇｔｅｅｒａｓｕｐａｙａｅｌａｌ，】９９５）。但这类检测技术耗时长、操作繁琐、灵敏度低、极易漏检，不宜对大批样品进行检测。黄健等ｆ１９９５）采用Ｔ－Ｅ染色法检测对虾白斑综合症，仅１０ｍｉｎ就可掌握对虾的细胞病理变化，诊断结果与组织切片的Ｈ．Ｅ染色法一致，此方法可用于白斑综合症的现场快速诊断。５．２免疫学诊断技术免疫学诊断技术建立在抗原抗体反应的基础上，操作简便，重复性好，现场应用性较强。其中酶联免疫吸附实验（ＥＬＩｓＡ）技术在ＷＳＳＶ的检测中已得到广泛应用。如黄健等运用单克隆抗体酶联免疫技术检测ＷＳＳＶ的宿主及传播途径（黄健等，１９９５）：战文斌等（１９９９）运用单克隆抗体的荧光抗体方法，原位观察ＷＳＳＶ在日本囊对虾体内的感染增殖；汪岷等（２０００）将多克隆抗体纯化，进行酶标记，建立了ＷＳＳＶ的直接双抗体夹心ＥＬＩＳＡ诊断法。Ｄａｉｅｔａｌ（２００３）利用噬菌体展示技术建立了抗ＷＳＳＶ的重组体单链可变片段抗体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ），这种抗体的检测灵敏度较高（虾投喂ＷＳＳＶ病料２４ｈ即可被检出），１ｈ即可出检测结果，且所需仪器设备简单，有望开发成一种简单、廉价、灵敏的检测试剂盒。５．３核酸分子生物学诊断技术核酸分子生物学诊断技术灵敏度较高，其中ＰＣＲ技术和核酸探针技术应用最广泛。ＷＳＳＶ的ＰＣＲ检测技术早已建立起来（Ｌｏｅｌａｌ，ｌ９９６ａ：Ｋａｓｏｍｃｈａｎｄｒａｅｌａｌ，】９９８；夏春等，１９９９）。ＰＣＲ具有灵敏度高、特异性强、操作简便和快速等特点，但容易出现假阳性。Ｐｅｎｇｅｔａｌ（１９９８）、谢数涛等（２００１）等以外引物预期扩增片断之内的部分短核苷酸序列为内引物，建立了ＷＳＳＶ的套式ＰＣＲ检

白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中问宿主的调查研究测方法；闰冬春等（２００３）在ＰＣＲ检测ＷＳＳＶ过程中使用尿嘧啶糖基酶（ＵＮＧ）防遗留污染，这样，出现假阳性的机率大大减少。另外，可用于模板定量的竞争ＰＣＲ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＰＣＲ）和实时ＰＣＲ（ｒｅａ｜．ｔｉｍｅＰＣＲ）技术已用于ＷＳＳＶ的研究（Ｔａｎｇｅｔａｌ，２０００；ｖｉｉａｙａｎｅｔａｔ，２００３；Ｄｕｒａｎｄｅｌ吐２００３）。核酸探针方法检测病毒ＤＮＡ，其检测灵敏度较ＰＣＲ方法低，但其阳性结果更为可靠。最常用的核酸探针检测技术有斑点杂交和原位杂交。斑点杂交是根据杂交膜上点样斑点的有无或强弱来判断样品是否带病毒。史成银等０９９９），Ｌｏｅｌａｌ（１９９９）等利用此方法检测ＷＳＳＶ；中国水产科学院黄海水产研究所病害室研制了“对虾暴发性流行病原核酸探针点杂交检测试剂盒”。原位杂交不需从组织提取核酸，可保持组织与细胞形态的完整性，能直观定位ＷＳＳＶ的靶组织及靶组织中对ＷＳＳＶ敏感的细胞类型（Ｃｈａｎｇｅｔａｌ，１９９８：Ｗｏｎｇｔｅｅｍｓｕｐａｙａｅｔａｌ，１９９５）。但原位杂交耗时长，操作繁琐，不适合大批样品的检测。每种方法都有自己的优点和不足，为了减少单一方法的不足带来的负面影响，在实际操作中，许多研究者同时运用多种技术来开展研究。如将免疫技术（免疫荧光抗体技术、酶联免疫技术、免疫电镜技术等）与单克隆抗体、基因探针、ＰＣＲ等技术相结合，敏感度、准确性大大提高。６防治措施６．１消除ＷＳＳＶ传染源，切断Ｗ￥ＳＶ传播途径消除垂直传播的传染源和传播途径ＷＳＳＶ垂直传播的传染源是携带ＷＳＳＶ的亲虾。因此，在亲虾选育中要采用免疫学、ＰＣＲ或核酸探针方法选育没有携带ＷＳＳＶ的虾作为亲虾。育苗期仔虾的ＷＳＳＶ检测是目前切断ＷＳＳＶ进入对虾养殖期的主要手段。除此之外，福尔马林浸泡法也在选择虾苗中得到广泛应用。在一个群体中，受ＷＳＳＶ感染的虾苗比未受ＷＳＳＶ感染的虾苗活力差，因而虾茧通过福尔马林浸泡后，能去掉带ＷＳＳＶ的虾茁，保留健康虾苗，使选购虾苗携带ＷＳＳＶ的个体减少（Ｗａｎｇｅｔａｌ，１９９８；何建国等，１９９９）。消除ＷＳＳＶ水平传播的传染源和传播途径ＷＳＳＶ的宿主很多，每一种在２０，

白斑综台症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究ＷＳＳＶ的暴发流行期都可能成为ＷＳＳＶ的水平传播的传染源，因此在清塘和消毒时一定要将ＷＳＳＶ的宿主消灭掉。与此同时，要切断对虾养殖过程中的水平传播途径，如在养殖池塘周围布置塑料薄膜围栏、在虾塘进水口安装过滤网等，这样可防止野生蟹子等较大型生物进入养殖池中，从而减少ＷＳＳＶ的传播（Ｗａｎｇｅｌａｌ，１９９９：李德尚等，２００２）。６．２增强对虾体质．提高对虾抗病能力增强对虾体质的途径有两条，一是供给优质的饵料，二是为对虾创造一个优良的环境条件。营养是基础，环境是条件，二者相辅相成，缺一不可（王克行，１９９９）。另外，现已发现多糖、生物碱、酮类、有机酸等经口服后能有效地激活免疫系统，增强抗病力。如Ｈｕａｎｇｅｌａｌ（１９９９）将Ｄ一１，３—１，６葡聚糖注入待产卵的斑节对虾亲虾体内，白斑综合症的红体和甲壳白斑等症状减少；在ＷＳＳＶ攻毒实验中，来自注射葡聚糖亲虾的幼体存活率明显高于对照组（来自未注射葡聚糖亲虾的幼体）。这表明葡聚糖能增强亲虾抗ＷＳＳＶ的能力，且这种抗ＷＳＳＶ的能力在一定程度上可传给幼体。Ｃｈａｎｇｅｌａｌ（２００３）研究发现斑节对虾经连续投喂ｌ％的Ｂ—ｌ，３一葡聚糖２０ｄ，能明显改善对虾的免疫机能并提高对虾在ＷＳＳＶ攻毒中的存活率。箫歌、王雷等研制出用于中国对虾病害防治的口服多糖免疫药物（箫歌，１９９４：王雷等，１９９５）。在养殖对虾的实践中，有人发现喂蛆蝇也可提高对虾的免疫力（王雷等，１９９５）。免疫接种是控制病毒性疾病的最有效措施，但虾与脊椎动物不同，缺少建立在抗体基础上的可记忆的免疫应答系统，因此疫苗仍然不能用于对虾ＷＳＳＶ的防治。６．３选育抗性品种因ＷＳＳＶ宿主多、传播途径复杂，其防治工作非常艰巨，在这种情况下选育抗性品种不失为一种捷径。ＳａｈｕｌＨｍｅｅｄｅｔａｌ（２０００）ＬＬ较了３种淡水沼虾Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍｉｄｅｌｌａ，Ｍｌａｍｅｒｒａｅ，Ｍｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉ对ＷＳＳＶ的抗性，发现浸浴、投喂、注射均不能使Ｍｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉ感染ＷＳＳＶ，其抗ＷＳＳＶ的机制需进一步研究，这有助于培育抗ＷＳＳＶ的对虾品种。Ｔａｎｇｅｔａｌ（２００３）研究发现预先感染传染性皮下及造血组织坏死病毒（ｈｙｐｏｄｅｒｍａｌａｎｄｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ，２

白斑综合症病毒（ｗｓｓｖ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究ＩＨＨＮＶ）的细角滨对虾∞ｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｓｔｙｌｉｒｏｓｔｒｉｓ对ＷＳＳＶ具有抗性，这种现象称为病毒干扰。这种干扰机制仍不清楚，可能是ＩＨＨＮＶ在对虾体内产生抗ＷＳＳＶ的干扰素类分子：另一种可能是ＩＨＨＮＶ感染后通过减少ＷＳＳＶ的病毒受体而阻止ＷＳＳＶ进入或通过耗尽虾体内ＷＳＳＶ复制所需的元件而阻止ＷＳＳＶ复制。将病毒干扰的细胞机制搞清楚将有助于培育抗ＷＳＳＶ的品种。６．４调整养殖模式在养殖过程中，要以防病为中心，因地制宜，打破单～养殖模式。现在已报道的防白斑综合症对虾养殖模式主要有以下几种：（１）混养模式。利用虾鱼贝藻对空间水质的不同要求及虾鱼贝的不同食性开展虾池立体综合养殖，以改善虾池生态环境，预防虾病。（２）淡水添加养殖模式。利用斑节对虾、凡纳滨对虾等的广盐性特点，在养殖过程中逐渐添加淡水，降低水体盐度。ＷＳＳＶ在低盐度条件下易失去活性，因此低盐度水体有一定的防病毒作用ｆ何建国等，１９９９）。另外，李群峰等（１９９７）报道了寿光市用地下卤水兑淡水养殖中国对虾成功的事例。将地下卤水的盐度用淡水调至对虾适应的范围内，作为对虾养殖用水。因地下卤水无外源性污染，可防止对虾病毒病的传播。（３）提水集约化养殖模式（高位池养殖模式）。提水集约化养殖模式最初见于台湾，后在泰国得到普及和应用，近几年在广东、海南等地迅速发展起来。该模式养殖池距海边８０．】００ｍ，有些５００．５０００ｍ；虾池高出海平面４－６ｍ，水泥护坡；用动力提升装置将海水抽到虾池中。高位池养殖模式因水质好、虾池不适宜蟹类等ＷＳＳＶ中问宿主的寄居和繁生，因而不易暴发白斑综合症（何建国等，１９９８）。６．５药物防治目前国内外还没有防治对虾自斑综合症的灵丹妙药。但在综合防治措施配套、使用技术规范的条件下，适当地使用药物也能收到一定的效果。如在饲料中添加抗菌素、大蒜等，能提高中国明对虾对白斑综合症的抗病能力；连翘、板蓝根、甘草等中草药浸出液也有一定的防病作用；维生素Ｃ对于促进对虾生长、提高对虾抗病力具有明显的效果（张道波等，２０００）大虾新宝、鱼虾救星、

臼斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究对虾克毒王等在养殖生产中也取得了一定成效（李健等，１９９５，１９９７）。但药物防治不能从根本上防治对虾白斑综合症，如果抱着“出现一种病就研究它的病原和发病机理，再找一种药物或方法来防治”这种就事论事的态度，而不是从养殖方式上做根本调整，新的病害将会不断出现。综上所述，对虾白斑综合症的病原、病理及诊断技术方面已取得了较大进展，随着ＷＳＳＶＤＮＡ全序列的测定，功能基因及功能蛋白的研究正成为热点。但由于对虾的水生生活习性及ＷＳＳＶ的细胞内寄生特性，ＷＳＳＶ的传播机理尚有一些问题未搞清楚，防治方面发展较慢，到目前为止还不能完全控制ＷＳＳＶ的疫情。使用健康或无特异病原的虾苗，结合彻底的消毒、隔离和健康养殖技术是彻底根治ＷＳＳ的综合技术方法，目前尚有许多基本的理论和技术问题有待进一步深入研究。参考文献包振民，胡景杰，姜明，等。杆状病毒感染越冬亲虾（Ｐｅｎａｅｕｓｃｈｅｎｅｓｉｓ）的研究—越冬亲虾感染及其垂直传播的可能性．青岛海洋大学学报，１９９７，２７（３）：３４７—３５１傅志茹，张勤，藏莉，等。卤水兑地下淡水中国对虾精养高产技术。水产科学，２０００，１９（１）：２７—３０何建国，莫福。对虾向斑综台症控制与广东省对虾养殖业持续发展。粤海通迅，１９９９，（２）：３４—３７何建国，莫福。对虾白斑综合症病毒暴发流行与传播途径、气候和水体理化因子的关系及其控制措施。中国水产。１９９９，（７）：３４—３７，４１何建国，莫福。对虾高位池养殖模式及其与病害控制的关系。中国水产，１９９８，（１２）：３０一３１何建国，周化民，江静波。白斑综合症杆状病毒致病性特征。热带海洋，１９９９，１８（１）：５９—６７何建国，周化民，姚伯，等。白斑综合症杆状病毒的感染途径和宿主种类。中山大学学报，１９９９，３８（２）：６５—６９。黄健，蔡生力，宋晓玲，等。对虾暴发性流行病病原的人工感染研究。海洋水产研究，１９９５，１６（１）：５１—５８２３，

白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰｅＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究黄健，宋晓玲，于佳，等。杆状病毒性的皮下及造血组织坏死一对虾暴发性流行病的病原和病理学。海洋水产研究，１９９５，１６（１）：１—１０黄健，杨丛海，于佳，等。Ｔ－Ｅ染色法用于对虾暴发性流行病的现场快速诊断。海洋科学．１９９５，（１）：２９—３３黄健，于佳，宋晓玲，等。１９９４年浙江省对虾暴发性流行病病原及传播途径的初步调查。海洋水产研究，１９９５，１６（１）：９１－－９８黄健，于佳，宋晓玲，等。对虾皮下及造血组织坏死轩状病毒的精细结构、核酸、多肽及血清学研究。海洋水产研究。１９９５，１６（１）：１１－－２３黄健，于佳，王秀华，等。单克隆抗体酶联免疫技术检测对虾皮下及造血组织坏死病的病原及其传播途径。海洋水产研究，１９９５。１６（１）：４０－－５０江世贵，翁少萍，吕玲，等。对感染白斑综合症病毒的亲虾子代的跟踪检测。中山大学学报（自然科学版），２００３，４２（１）：６６—６９雷质文，黄健，寇运同，等。对虾白斑综合症（ＷＳＳ）的分子流行病学研究进展。中国水产科学，２００２，９（３）：２６０－－２６４雷质文，黄健，史成银，等。白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的宿主调查。海洋与湖沼，２００２，３３（３）：２５０一２５８李德尚，董双林。对虾白斑综合症病毒病围栏封闭预防技术研究简报。海洋科学，２００２，２６（４）：６７—６８李健，孙修涛．郭可寿，等。利用对虾病害防治药物进行封闭式内循环水养殖对虾试验。海洋科学，１９９５，（５）：６—９李健，孙修涛，刘萍，等。抗病毒药物防治对虾暴发性流行病试验。中国水产科学，１９９７，４（２）：８１－－８５李群峰，江涛，丁志起，等。地下卤水养殖中国对虾试验报告。齐鲁渔业，１９９７，１４（４）：２２—２４刘萍，孔杰，李健，等。自斑综合症病毒（ｗｓｓｖ）对中国对虾卵及各期幼体人工感染的试验研究。海洋水产研究，２００１，２２（１）：１—６刘萍，孔杰，石拓，等。暴发性流行病病原对中国对虾亲虾人工感染及对子代影响的ＰＣＲ检测。海洋与湖沼，１９９９，３０（２）：１３９—１４４史成银，宋晓玲，黄健，等。核酸斑点杂交分析法检测对虾皮下及造血组织坏死杆状病毒（ＨＨＮＢＶ）。海洋与湖沼，１９９９，３０（５）：４８６－－４８９宋晓玲－黄健，王崇明，等。皮Ｆ及造血组织坏死杆状病毒对中国对虾亲虾的人工感染。水产学报，１９９６，２０（４）：３７４－－３７８

白斑综合症璃毒（鸭ｓ”的ＰＣＲ捡测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究汪岷，戴继勋，张士璀，等。用ＥＬＩＳＡ检测中国对虾的自斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）。海洋学报，２０００，２２（２）：１３２—１３６王克行。虾病防治原理介绍。科学养鱼，１９９９，（９）：２８—２９王雷，李光友，毛远兴。口服免疫药物后中国对虾某些血淋巴因子的测定及方法研究。海洋与潮沼，１９９５，２６（１）：３４－－４１夏春，黄健。ＰＣＲ法检测对虾皮下和造血器官坏死杆状病毒。微生物学报，１９９９，３９（２）：１７１—１７３箫歌。中国对虾病害防治新技术一口服多糖免疫药物研制成功。海洋与湖沼，１９９４，２５（１）：１１３—１１４谢数涛，何建国，杨晓明，等。套式ＰＣＲ检测斑节对虾白斑症病毒（ＷＳＳＶ）。青岛海洋大学学报，２００１，３１（２）：２２０－－２２４谢数涛．邱德全，何建国，等。几种理化因子对斑节对虾白斑杆状病毒（ｗＳＢｖ）感染力的影响。海洋科学，２０００，２４（３）：５２—５４，３０徐耀先，解梦霞，向近敏，等。病毒命名与分类系统研究进展。中国病毒学，１９９９，１４（３）：１９１－－２０４闫冬春，黄健，董双林，等。ＰＣＲ检测对虾白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）中使用ＵＮＧ防遗留污染。海洋水产研究，２００３，２４（３）：２９—３３战文斌，王远红，钟木信一，等。白斑症病毒在日本对虾体内的感染增殖。水产学报，１９９９，２３（３）：２７８－－２８２张奇亚。国内外对虾病毒病研究综述。现代渔业信息，１９９５，１０（１０）：１－－６ＣｈａｎｇＣＦ＇ＳｕＭＳ，ＣｈｅｎＨＹ＇ｅｔａ１．ＤｉｅｔａｒｙＢ一１，３－ｇｌｕｃａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｉｍｐｒｏｖｅｓｉｍｍｕｎｉｔｙａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌｏｆＰｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｗｉｔｈｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ．ＦｉｓｈａｎｄＳｈｅｌｌｆｉｓｈＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００３．】５：２９７－３１０ＣｈａｎｇＰＳ，ＣｈｅｎＨＣ，ＷａｎｇＹＣ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ（ＷＳＢＶ）ｔａｒｇｅｔｏｒｇａｎｓｉｎｔｈｅＰｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎｂｙｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．ＤｉｓｅａｓｅｓｏｆＡｑｕａｔｉｃＯｒｇａｎｉｓｍｓ，ｌ９９６，２７：】３１－１３９ＣｈａｎｇＰＳ，ＣｈｅｒｔＨＣ，ＷａｎｇＹＣ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｌｄｓｈｒｉｍｐ，ｃｒａｂａｎｄｌｏｂｓｔｅｒｓｂｙｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａｑｕａｅｕｌｔｕｒｅ，１９９８，１６４：２３３－－２４２ＣｈａｎｇＹＳ，ＬｏＣＦ，ＰｅｎｇＳＥ，ｅｌａ１．Ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ）ＰＣＲ．ｐｏｓｉｔｉｖｅＡｒｔｅｍ／ａｃｙｓｔｓｙｉｅｌｄＰＣＲ—ｎｅｇａｔｉｖｅｎａｕｐｌｉｉｔｈａｔｆａｉｌｔｏｔｒａｎｓｍｉｔＷＳＳＶｗｈｅｎｆｅｄｔＯｓｈｒｉｍｐｐｏｓｔｌａｒｖｅ．ＤｉｓｅａｓｅｓｏｆＡｑｕａｔｉｃＯｒｇａｎｉｓｍｓ，２００２，４９：】一１０ＣｈｅｎＬＬ，ＷａｎｇＨＣ，ＨｕａｎｇＣＪ，ｅｌａ１．ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｇｅｎｅｏｆｓｈｒｉｍｐｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００２．３０１：１３６一１４７

白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主韵调查研究ＣｈｏｕＨＹ，ＨｕａｎｇＣＹ，ＷａｎｇＣＨ，ｅｌａ１．ＰａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆａｂａｃｕｌｏｖｉｍｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｃａｕｓｉｎｇｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｐｅｎａｅｉｄｓｈｒｉｍｐｉｎＴａｉｗａｎ．ＤｉｓＡｑｕａｔＯｒｇ，１９９５，２３：１６５—１７３ＤａｉＨＰ＇ＧａｏＨ，ＺｈａｏＸＹ，ｅｌａ１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｆｒｏｍｓｈｒｉｍｐ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，２００３，２７９：２６７－－２７５ＤｕｒａｎｄＳＶ，ＲｅｄｍａｎＲＭ，ＭｏｈｎｅｙＬＬ，ｅｌａ１．ＱｕａｌｉｔａｔｉｖｅａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｓｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｖｉｒｕｓｌｏａｄｏｆｔａｉｌｓａｎｄｈｅａｄｓｏｆｓｈｒｉｍｐａｃｕｔｅｌｙｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＷＳＳＶ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２００３，２１６９～１８ＧｕａｎＹＱ，ＹｕＺＭ，ＬｉＣⅥＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎＭａｒｓｕｐｅｎａｅｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２００３，８３：２５７－－２６０ＨｕａｎｇＣＣ，ＳｏｎｇＹＬ．Ｍａｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆｉｍｍｕｎｉｔｙｔｏｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ）ｉｎｓｈｒｉｍｐ（Ｐｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ）．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌａｎｄＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９９，２３：５４５－－５５２ｌｎｏｕｙｅＫ，ＹａｍａｎｏＫ，ＩｋｅｄａＮ，ｅｌａ１．Ｔｈｅｐｅｎａｅｉｄｒｏｄ－ｓｈａｐｅｄＤＮＡｖｉｒｕｓ（ＰＲＤＶ），ｗｈｉｃｈｃａｕｓｅｓｐｅｎａｅｉｄａｃｏｔｅｖｉｒｅｍｉａ（ＰＡＶ）．ＦｉｓｈＰａｔｈｏｌｏｇｙ，］９９６，３１（１）：３９—４５ＫａｓｏｒｎｃｈａｎｄｒａＪ，ＢｏｏｎｙａｒａｔｐａｌｉｎＳ，ＩｔａｍｉＴＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｗｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｐｅｎａｅｉｄｓｈｒｉｍｐｉｎＡｓｉａ：ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ．Ａｑｕａｃｌｔｕｒｅ，１９９８．１６４：２４３－－２５ｌＬｊｇｈｔｎｅｒＤｖ．Ａｈａｎｄｂｏｏｋｏｆｓｈｒｉｍｐｐａｔｈｏｌｏｇｙａｎｄｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｆｏｒｄｉｓｅａｓｅｓｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｐｅｎａｅｉｄｓｈｒｉｍｐ．Ｓｅｃｔｉｏｎ３：ＶｉｒｕｓＷｏｒｌｄＡｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ．Ｌｏｕｉｓｉａｎａ：ＢｏｔｏｎＲｏｕｇｅ，１９９６ＬｉｇｈｔｎｅｒＤ圹ＴｈｅＰｅｎａｅｉｄｓｈｒｉｍｐｖｉｒｕｓｅｓＴＳ钐１ＨＨＮ彩ＷＳＳ蟛ａｎｄＹＨＶ：ｃｕｒｒｅｎｔｓｔａｔｕｓｉｎｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｓ，ａｖａｉｌａｂｌｅｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄｍａｎａｇｅｍｅｎｔｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＡｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１９９９，９（２）：２７—５２ＬｉｕＷＪ，ＹｕＨＴ，ＰｅｎｇＳＥ，ｅｌａ１．Ｃｌｏｉｎｇ，ｃｈｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄｐｈｙＩｏｇａｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｓｈｒｉｍｐｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｇｅｎｅｔｈａｔｅｎｃｏｄｅｓａｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００１．２８９：３６２—３７７ＬｏＣＦ，ＨｏＣＨ，ＣｈｅｎＣＨ，ｅｌａＬＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｉｓｓｕｅｔｒｏｐｉｓｍｏｆｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ）ｉｎｐｅｎｅｉｄｂｒｏｏｄｅｒｓｏｆＰｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎｗｉｔｈａｓｐｅｃｉａｌｅｍｐｈａｓｉｓｏｎｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｏｒｇａｎｓ．ＤｉｓｅａｓｅｓｏｆＡｑｕａｔｉｃＯｒｇａｎｉｓｍｓ，１９９７，３０：５３—７２ＬｏＣＦ，ＨｓｕＨＣ，ＴｓａｉＭＦ＇ｅｔａ１．ＳｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓｏｆｓｈｒｉｍｐｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ．ＤｉｓＡｑｕａｔＯｒｇ，１９９９，３５：１７５—１８５ＬｏＣＦ＇ＬｅｕＪＨ，ＨｏＣＨ，ｅｔａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＷＳＢＶ）ｉｎｐｅｎａｅｉｄｓｈｒｉｍｐｓｕｓｉｎｇｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ．ＤｉｓＡｑｕａｔＯｒｇ，１９９６ａ，２５：１１１·１４Ｔ

由斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中问宿主的调查研究ＭａｅｄａＭ，ＫａｓｏｍｃｈａｎｄｒａＪ，ＩｔａｍｉｔｅｔａＬＥｆｆｅｃｔｏｆｖａｒｉｏｕｓｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｏｎｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ）ｆｒｏｍＰｅｎａｅｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ（Ｊａｐａｎ）ａｎｄＰｍｏｎｏｄｏｎ（Ｔｈａｉｌａｎｄ）．Ｆｉｓｈｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９８，３３（４）：３８１－－３８７ＮａｄａｌａＥＣＢ，ＴａｐａｙＬＭ，ＬｏｈＰＣ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｏｎ—ｏｃｃｌｕｄｅｄｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ．１ｉｋｅａｇｅｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｔｏｐｅｎａｅｉｄｓｈｒｉｍｐ．ＤｉｓＡｑｕａｔＯｒｇ，１９９８，３３：２２１－－２２９ＮｕｎａｎＬＭ．ＬｉｇｈｍｅｒＤｖ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｎｏｎｅ－ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｇｅｎｅｐｒｏｂｅｂｙＰＣＲｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ｗｓｓｖ）．ＪＶｉｒｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，１９９７，６３（１—２）：１９３－－２０１ＮｕｎａｎＬＭ，ＰｏｕｌｏｓＢＴ，Ｌｉｇｔ，ｔｎｅｒＤｖ．Ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ）ａｎｄｙｅｌｌｏｗｈｅａｄｖｉｒｕｓ（ＹＨｖ）ｉｎｉｍｐｏｒｔｅｄｃｏｍｍｏｄｉｔｙｓｈｒｉｍｐ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１９９８，１６０：１９—３０ＰｅｎｇＳＥ，ＬｏＣＦ，ＬｉｎＳＣ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｆｒｏｍｐｒｅ·ｐａｔｅｎｔｔｏｐａｔｅｎｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＷＳＳＶｉｎＰｍｏｎｏｄｏｎｔｒｉｇｇｅｒｅｄｂｙｐｅｒｅｉｏｐｏｄｅｘｃｉｓｉｏｎ．ＦｉｓｈＰａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９８，３３（４）：３９５－－４００ＲａｊｅｎｄｒａｎＫＶ＇ＶｌｊａｙａｎＫＫ，ＳａｎｔｉａｇｏＴＣ，ｅｔａ１．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｈｏｓｔｒａｎｇｅａｎｄｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｔｏｇｙｏｆｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ）ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｓｈｒｉｍｐ，ｐｒａｗｎｓ，ｃｒａｂｓａｎｄｌｏｂｓｔｅｒｓｆｒｏｍＩｎｄｉａ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｆｉｓｈＤｉｓｅａｓｅｓ，１９９９，２２：１８３—１９１Ｓａｈｕ］ＨａｍｅｅｄＡＳ，ＭｕｒｔｈｉＢＬＭ，ＲａｓｈｅｅｄＭ，ｅｔａ１．ＡｎｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆＡｒｔｅｍｉａａｓａｐｏｓｓｉｂｌｅｖｅｃｔｏｒｆｏｒｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ）ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｔｏＰｅｎａｅｕｓｉｎｄｉｃｕｓ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２００２，２０４：１—１０ＳａｈｕｌＨａｍｅｅｄＡＳ，ＸａｖｉｅｒＣｈａｒｌｅｓＭ，ＡｎｉｌｋｕｍａｒＭ．ＴｏｌｅｒａｎｃｅｏｆＭａｅｒｏｂｒａｃｈｉｕｍｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉｔｏｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ．２０００．１８３：２０７—２】３ＳｏｔｏＭＡ，ＬｏｔｚＪＭ．ＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉａｎｄＬ．ｓｅｔｉｆｅｒｕｇ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｌｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２００１．７８：９—１５ＳｕｄｈａＰＭ，ＭｏｈａｎＣＶＳｈａｎｋａｒＫＭ，ｅｔａ１．ＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｉｎＩｎｄｉａｎｃｕｌｔｕｒｅｄｐｅｎａｅｉｄｓｈｒｉｍｐＡｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１９９８，１６７：９５—１０１ＴａｎｇＫａｔｈｙＦＪ，ＤｕｒａｎｄＳｔｅｐｈａｎｉｅｖ，ＷｈｉｔｅＢｒｅｎｄａＬ，ｅｔａ１．ＩｎｄｕｃｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎＰｅｎａｅｕｓｓｔｙｌｉｒｏｓｔｒｉｓｔｈｒｏｕｇｈｐｒｅ—ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｈｙｐｏｄｅｒｍａｌａｎｄｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｖｊｒｕｓ～ａｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｙ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２００３，２１６：１９—２９ＴａｎｇＫａｔｈｙＦＪ，ＬｉｇｈｔｎｅｒＤｏｎａｌｄＶＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓＤＮＡｔｈｒｏｕｇｈａｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２０００，１８９：１ｌ－－２１ｖａｎＨｕｌｔｅｎＣｗ＇ＷｉｔｔｅｖｅｌｄｔＪ，ＳｎｉｐｐｅＭ，ｅｔａ１．ＷｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｅｎｖｅｌｏｐｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２８ｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｓｙｓｔｅｍｉｃｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｓｈｒｉｍｐＶｉｒｏｌｏｇｙ，２００１，２８５：２２８－－２３３ｖａｎＨｕｌｔｅｎＭＣｗ，ＷｅｓｔｅｎｂｅｒｇＭ，ＧｏｏｄａｌｌＳＤ，ｅｔａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｗｏｍａｊｏｒｖｉｒｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｓｏｆｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｏｆｓｈｒｉｍｐ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００，２６６：２２７－－２３６ｖａｎＨｕｌｔｅｎＭＣｗ，ＷｉｔｔｅｖｅｌｄｔＪ，ＰｅｔｅｒｓＳ，ｅｌａ１．ＴｈｅｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓＤＮＡｇｅｎｏｍｅ２７

白斑综台症病毒（ＩＳＳＶ）的ＰＣＲ榆测条件优化及浮ｉ｝｝动物中问宿主的调查研究ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００１，２８６（１）：７—２２ＶｉｊａｙａｎＫＫ，ＢａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎＣＰ’ＪｉｔｈｅｎｄｒａｎＫＰ＇ｅｔａ１．ＨｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙｏｆＹ－ｏｒｇａｎｉｎＩｎｄｉａｎｗｈｉｔｅｓｈｒｉｍｐＦｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅｕｓｉｎｄｉｃｕｓ，ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２００３，２２ｌ：９７—１０６ＷａｎｇＣＨ，ＬｏＣＦ，ＬｅｕＪＨ，ｅｌ０２．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｗｈｉｔｅｓｐｏｔ——２４２ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＷＳＢＶ）ｏｆＰｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ．ＤｉｓＡｑｕａｔ０，吕１９９５，２３：２３９ＷａｎｇＣＳ，ＴａｎｇＫＦＪ，ＫｏｕＧＨ，ｅｔ０２．ＬｉｇｈｔａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｅｖｉｄｅｎｃｅｏｆｗｈｉｔｅｓｐｏｔｄｉｓｅａｓｅｉｎｔｈｅｇｉａｎｔｔｉｇｅｒｓｈｒｉｍｐＰｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ（Ｆａｂｒｉｅｉｃｕｓ），ａｎｄｔｈｅｋｕｒｎｍａｓｈｒｉｍｐＰｅｎａｅｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ（Ｂａｔｅ）ｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎＴａｉｗａｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｆｉｓｈＤｉｓｅａｓｅｓ，１９９７，２０：３２３－－３３１ＷａｎｇＱ，ＷｈｉｔｅＢｒｅｎｄａＬ，ＲｅｄｍａｎＲｉｍＭ，ｅｌ０２．ＰｅｒｐｏｓｔｌａｒｖａｅａｎｄｏｓｃｈａｌｌｅｎｇｅｏｆＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｒａｅｉＦａｒｆａｎｔｅｐｅｎａｅｕｓｄｕｏｒａｒｕｍｊｕｖｅｎｉｌｅｓｗｉｔｈｓｉｘｇｅｏｇｒａｐｈｉｃｉｓｏｌａｔｅｓｏｆｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１９９９，１７０：１７９一】９４ＷａｎｇＹＧＨａｓｓａｎＭＤ，ＳｈａｒｉｆｆＭ，ｅｔ０２．Ｈｉｓ：￡ｏｐｍｈｏｌｏｇｙａｎｄｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙｏｆｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ｗｓｓｖ）ｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎＰｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎｆｒｏｍｐｅｎｉｓｕｔａｒＭａｌａｙｓｉａｗｉｔｈｅｍｐｈａｓｉｓｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｗｈｉｔｅｓｐｏｔｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＤｉｓｅａｓｅｓｏｆＡｑｕａｔｉｃＯｒｇａｎｉｓｍｓ，１９９９，３９：ｌ—ｌ１ＷａｎｇＹＧＬｅｅＫＬ，ＮａｊｉａｈＭ，ｅｔ０２．Ａｎｅｗｂａｃｔｅｒｉａｌｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（Ｂｗｓｓ）ｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｔｉｇｅｒｓｈｒｉｍｐＰｅｎｏｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎａｎｄｉｔｓｃｏｐａｒｉｓｉｏｎｗｉｔｈｗｈｉｔｅｃａｕｓｅｄｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＷＳＳ）ｂｙｖｉｒｕｓ．ＤｉｓｅａｓｅｓｏｆＡｑｕａｔｉｃＯｒｇａｎｉｓｍｓ，２０００，４１：９一１８ＷａｎｇＹＧＳｈａｒｉｆｆＭ，ＳｕｄｈａＰＭ，ＳｒｉｎｉｖａｓａＲａｏＰＳ，ＨａａｓａｎＭＤ＇ＴａｎＬＴ．Ｍａｎａｇｉｎｇｗｈｉｔｅｓｐｏｔｄｉｓｅａｓｅｉｎｓｈｒｉｍｐ．ＩＮＦＯＦＩＳＨＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ｌ９９８，（３）：３０—３６ＷａｎｇＹＧＴａｎＯＬ，ＬｅｅＫＬ，ＨａｓｓａｎＭＤ＇ＳｈａｒｉｆｆＭ（１９９９）Ｈｅａｌｔｈｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｓｈｒｉｍｐｄｕｒｉｎｇｇｒｏｗ－ｏｕｔ．ＩＮＦＯＦＩＳＨＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，】９９９，（４）：３０一３６ＷａｎｇＹｕ－ｅｈｉ，ＬｏＣｈｕ－ｆａｎｇ，ＣｈａｎｇＰｏｈ－ｓｈｉｎｇ，ｅｔ０２．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｗｈｉｔｅｓｐｏｔｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｉｎｓｏｍｅｃｕｌｔｕｒｅｄ２３ｌａｎｄｗｉｌｄｄｅｃａｐｏｄｓｉｎＴａｉｗａｎ．ＡｑｕａｃｕｌｔＵｒｅ，１９９８，１６４：２２１—ＷｏｎｇｔｅｅｒａＳｕｐａｙａＣ，ＶｉｃｋｅｒｓｔｈａｔＯＣＣＵＴＳＪＥ，ＳｒｉｕｒａｉｒａｔａｎａＳ，ｅｌ０２．Ａｎｏｎ—ｏｃｃｌｕｄｅｄ．ｓｙｓｔｅｍｉｃｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｉｎｔｈｅｉｎｃｅｌｌｓｏｆｅｃｔｏｄｅｒｍａｌａｎｄｍｅｓｏｄｅｒｍａｌｏｒｉｇｉｎａｎｄｃａｕｓｅｓｈｉｇｈｍｏｒｔａ／ｉｔｙｂｌａｃｋｔｉｇｅｒｐｒａｗｎＰｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ．ＤｉｓＡｑｕａｔｏｒｇ．１９９５．２１：６９—７７＂ｄａｎＤＣ，ＤｏｎｇＳＬ，ＨｕａｎｇＪ，ｅｌ０２．Ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（Ｗｓｓｖ）ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＰＣＲｉｎｒｏｔｉｆｅｒｓａｎｄｒｏｔｉｆｅｒｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓｆｒｏｍｓｈｒｉｍｐｐｏｎｄｓｅｄｉｍｅｎｔｓ．ＤｉｓｅａｓｅｓｏｆＡｑｕａｔｉｃＯｒｇａｎｉｓｍｓ，２００４，ｉｎｐｒｅｓｓ＂ｆａｎｇＦ＇ＨｅＪ，ＬｉｎＸ，ｅｔ０２．Ｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｓｈｒｉｍｐｗｈｉｔｅｓｐｏｔｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｖｉｒｕｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，２００１，７５（２３）：１１８ｌｌ—１１８２０２８

白斑综合症嫡毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究ＹｏｇａｎａｎｄｈａｎＫ，ＳａｔｈｉｓｈＳ，ＭｕｒｕｇａｎＶ，ｅｌａ１．ＳｃｒｅｅｎｉｎｇｔｈｅｏｒｇａｎｓｆｏｒｅａｒｌｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｉｎＰｅｎａｅｕｓｉｎｄｉｃｕｓｂｙｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙａｎｄＰＣＲｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２００３，２１５：２１－－２９ＹｏｇａｎａｎｄｈａｎＫ，ＴｈｉｒｕｐａｔｈｉＳ，ＳａｈｕｌＨａｍｅｅｄＡＳ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｉｎｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ—ｉｎｆｅｃｔｅｄｓｈｒｉｍｐ，Ｐｅｎａｅｕｓｉｎｄｉｃｕｓ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２００３，２２１：Ｉ一１Ｉ２９＋。

白斑综台症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究（二）轮虫休眠卵研究进展Ｒｅｖｉｅｗｏｎｒｏｔｉｆｅｒｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｒｅｓｅａｒｃｈ摘要：综述了近年来国内外对轮虫休眠卵的研究概况。重点介绍了轮虫体眠卵的形态、影响轮虫休眠卵形成的因素、轮虫休眠卵的萌发形式及影响其萌发的因素、自然水体中轮虫休眠卵的研究概况。关键词：轮虫休眠卵：形态；形成；萌发Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｒｏｔｉｆｅｒｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｏｆｈｏｍｅａｎｄａｂｒｏａｄｗａｓｒｅｖｉｅｗｅｄ，Ｔｈｅｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｅｍｐｈａｓｅｓｗｅｒｅｏｎｒｏｔｉｆｅｒｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｆａｃｔｏｒｓｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｒｏｔｉｆｅｒｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｐｒｏｄｕｃｉｎｇ，ｔｈｅｈａｔｃｈｆｏｒｍｓｏｆｒｏｔｉｆｅｒｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇａｎｄｆａｃｔｏｒｓｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｉｔｓｈａｔｃｈ，ｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｒｏｔｉｆｅｒｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓｏｆｎａｔｕｒａｌｐｏｎｄｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｏｔｉｆｅｒｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇ；ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ；ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ；ｈａｔｃｈ轮虫休眠卵是单巢目轮虫在恶劣生态条件下形成的滞育结构，是轮虫有性生殖的产物，对轮虫抵御不良环境及保种、繁衍和散布具有重要意义。轮虫是经济水生动物的开口饵料，其休眠卵已在水产育苗上得到广泛应用，轮虫休眠卵表面携带病原、感染经济水生动物的问题已受到关注。另外，在水生态毒理学研究中，使用轮虫休眠卵孵出的第一代非混交雌体比使用克隆培养的轮虫精确度更高，因此，轮虫休眠卵的研究又具有重要的现实意义。国内外一些学者对轮虫休眠卵的形态、形成、萌发等进行了深入的研究，本文对相关文献作一综述。１轮虫休眠卵的形态轮虫体眠卵的形态引起国内外学者的关注：李永函等（１９９１）用图鉴方式描述了我国北方地区池塘习见２０种轮虫休眠卵的形态结构；林里等（２００１）用光学显微镜和扫描电镜对东湖１４种轮虫休眠卵形态进行了观察；有关轮虫休眠卵３０ｒ

白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究超微结构的研究，先后有Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９７８）、Ｗｕｒｄａｋｅｌａｌ（１９７８）、翟宝香等（１９８７）、林里等（１９９７）、张东升等（１９９９）等人对６属２０种轮虫休眠卵做了透射和扫描电镜观察，张东升等（２００１）用扫描电镜还观察了４种轮虫休眠卵用不同浓度盐溶液处理后的形态。轮虫休眠卵呈卵圆形、球形，外被一层厚厚的深色硬壳，表面具棘（王家楫，１９６１）。在光镜下，成熟的轮虫休眠卵有３层膜，轮虫幼体孵化、离开空壳（第一层膜）后仍被有２层膜。在一些种类第３层膜可能完全消失，在多数种类只能看到２层膜，因第３层膜（最内层膜）在休眠开始后才形成（Ｐｏｕｒｒｉｏｔｅｔａｌ，１９８３）。在电镜下，壳的最外层又由２层构成，一层具小窝，另一层具条纹。第２层的主要成分是几丁质，在电镜下致密，有时与第一层连在一起，有时与第一层之间具一胚外间隙（ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｐａｃｅ）（Ｗｕｒｄａｋｅｔａｌ，１９７８）。坚硬的外壳使休眠卵可以抵御捕食者消化酶的作用和外界不良环境，但壳饰的生物学作用仍不十分清楚。一些种类的轮虫休眠卵（如臂尾轮虫休眠卵）一侧具卵盖。据Ｗｕｒｄａｋ（１９７８）对卵盖的电镜观察，卵盖是体眠卵第一层膜在胚胎端向下的一段凹陷，此位置的第一层卵膜非常薄，轮虫可以从此处孵出。张东升等（２００１）认为所有的休眠卵都应有卵盖，孵盖不应作为休眠卵的分类依据，～些种类的休眠卵未看到卵盏可能与观察角度有关。不同种轮虫的休眠卵形态、壳饰各不相同，具有种的特异性，可作为系统分类的依据（Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９７８）。但在某些轮虫．即使同一种中休眠卵形态亦存在较大的差异。林里等（２００１）发现同是取自东潮的两枚萼花臂尾轮虫休眠卵的壳饰不同，且与Ｗｕｒｄａｋｅｔａｌ（１９７８）展示的２枚该种轮虫体眠卵的壳饰亦不相同。Ｇｉｌｂｅｒｔ也认为同一种轮虫在不同地区、同一水体不同季节、甚至同一母体产生的休眠卵形态上存在相当大的差异，如１９６４年８月在Ｋａｒｐｏｖ’Ｓ池塘中采到的萼花臂尾轮虫休眠卵与１９６５年５月在该池中采得的同种卵有很大不同，前者较大（１４５－－１６０×９０－－１０５），后者较小（１２５—１３５×８５－－９０），颜色以前者更深，壳饰也不同。初产生的休眠卵和完成休眠后的隔年休眠卵在形态结构上大致相同，但后者常具有一个或大或小的气室，壳纹不如刚形成时那样清晰（李永函３ｌ

Ｉ＝＿ｆ斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰｃＲ检测条件优化及浮游动物中问宿主的调查研究等，１９９１）。２轮虫休眠卵的形成轮虫休眠卵的形成需经过以下几个步骤：随着轮虫孤雌生殖的进行，由非混交雌体（Ａｍｉｃｔｉｃｆｅｍａｌｅ）产生混交雌体（Ｍｉｅｔｉｃｆｅｍａｌｅ）；混交雌体产生雄轮虫：混交雌体与雄轮虫交配、受精；受精后的混交雌体产休眠卵（Ｐｏｕｒｒｉｏｔｅｔａｌ，１９８３）。影响轮虫休眠卵形成的因素很多，除品系遗传特性及母体年龄等内部因素外，环境温度、盐度变化、饵料种类和数量等被认为是最重要的外部因素。２．１遗传因素对休眠卵形成的影响Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９７４）的研究表明，轮虫的有性生殖在一定程度上由遗传控制。Ｈｉｎｏｅｌａｌ（１９７７）研究了褶皱臂尾轮虫的２０个品系，发现一些品系在培养２５代后才产生混交雌体，而另一些品系几乎每代都有混交雌体产生，因此认为混交雌体的产生是受基因控制的。Ｌｕｂｚｅｎｓ“ａｌ（１９８８）在大量研究的基础上，提出轮虫的有性生殖由遗传因素决定，环境因子对其具有调节作用。Ｐｏｚｕｅｌｏｅｌａｌ（１９９３）也得出了相似的结论。２．２母体年龄对休眠卵形成的影晌多数研究表明，轮虫母体的年龄与混交雌体的产生呈负相关。萼花臂尾轮虫（Ｂｒａｃｈｉｏｎｕｓｃ∞心￡加，埘和红臂尾轮虫∞．ｒｕｂｅｎｓ）在其一生中的最初几天，所产卵的８００／ｏ－－９０“／ｏ发育成混交雌体，随着母体年龄的增大，该百分率下降（Ｐｏｕｒｒｉｏｔｅｔａｌ，１９８３）。Ｃｌｅｍｅｎｔｅｌａｌ（１９７７，１９８０）研究发现，Ｎｏｔｏｍｍａｔａｃｏｐｅｕｓ母体年龄对后代混交雌体的产生也具有相似的影响，这种影响甚至涉及到祖代雌体的年龄。２３温度对休眠卵形成的影响温度对轮虫休眠卵形成的影响常因轮虫种类及其品系的不同而异

白斑综合症病毒（ｗｓｓｖ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究（Ｈａｇｉｗａｒａｅｔ口‘１９８８，１９９１；Ｉｍａｎｕｒａｅｌａｌ，１９７９）。Ｋａｍｉｕｒａ品系的褶皱臂尾轮虫ｆＢｒａｃｈｉｏ删ｓ口ｌｉｃａｔｉｌｉｓ）在２５。Ｃ下批量培养时无有性生殖发生，当将其用低温（１２０Ｃ）处理２０ｄ以上时可显著诱导混交雌体的形成，之后将培养温度升高至２５。Ｃ后，可加速休眠卵的产生（Ｋａｇｏｎｅｅｌａｔ，１９９７）：叠ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｒｍｉｓＳｃｈｕｇｕｎｏｆｆ休眠卵形成效率随着温度的升高而增大（Ｈａｇｉｗａｒａｅｔａｔ，１９９１）；小种轮虫在高温（２８０Ｃ，３２。Ｃ）条件下所产生的休眠卵量明显高于低温（２２０Ｃ，２５。Ｃ）条件下所产生的休眠卵量（商占恒等，２００３）；萼花臂尾轮虫高温较低温时休眠卵产生得早（王金秋等，１９９８）。不同种轮虫产休眠卵的适宜温度不同，因此，人们可通过调节温度提高休眠卵形成的效率。如萼花臂尾轮虫在２２。Ｃ下培养５天后再转入２７。Ｃ培养可加速体眠卵的产生，使休眠卵的最大形成效率提前出现（刘桂云等，２００２）。褶皱臂尾轮虫进行有性生殖的适宜温度是１０—１５０Ｃ，低于此温度，轮虫休眠卵的产生就需要更长的时问（Ｈａｇｉｗａｒａｅｌａｌ，２００１），因此，可在较低温度水平下促进褶皱臂尾轮虫进行有性生殖，然后提高温度促进受精轮虫产休眠卵（Ｋｏｇａｎｅｅｌ口Ｚ．１９９７）。２，４食物质量对休眠卵形成的影晌食物的质量是影响轮虫休眠卵形成的重要因素。杨家新等（１９９８）分别以椭圆卵囊藻（Ｏｏｃｙｓｔｉｓｅｌｌｉｐｔｉｃａ）、蛋白核小球藻（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）及由两者所组成的混合藻为食物培养萼花臂尾轮虫，发现后代中混交雌体的百分率依次降低。商占恒（２００２）比较了分别投喂海水小球藻、酵母及二者混合物对轮虫产生休眠卵的影响，结果表明，投喂海水小球藻有利于轮虫休眠卵的产生，这可能与海水小球藻的营养高于酵母有关。Ｂｅｎ．ｍｍｏｔｚｅｌａｌ（１９８２）、Ｌｕｂｚｅｎｅｔａｌ（１９８０）研究表明，饲喂在浓盐溶液中生长的藻（ｓａｌｔ—ｇｒｏｗｎａｌｇａｅ）司Ｆ促进褶皱臂尾轮虫进行有性生殖及产休眠卵，究其原因，在盐水中生长的藻可能含有某种控制、诱导轮虫有性生殖的内部因子，尽管这一机制仍不清楚，但人们可以通过调控藻的生长状况来诱导轮虫的有性生殖。一定范围内的食物浓度对轮虫混交雌体的百分率和受精率无显著影响（Ｓｎｅｌｌｅｌａｌ，１９８７；席贻龙等，１９９８，２０００），王３３

白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究金秋等（１９９８）的研究也表明饵料密度对轮虫休眠卵的产生时间无显著影响。２．５盐度对休眠卵形成的影响盐度是影响威水性轮虫种类休眠卵形成的重要外源性因子。ＬｕｂｚｅｎｓｅｔａＩ（１９８０）发现褶皱臂尾轮虫在１００％海水中（盐度３８％０，３００Ｃ）即使种群密度超过４０个雌体／ｌＴｌｌ也不产生混交雌体，但当转移至５０９６或２５％海水中时会产生较高比率的混交雌体。有关盐度影响轮虫混交雌体形成的机理仍不清楚。除以上因素外，生育酚、光照周期和种群密度是２０世纪７０年代中期以前已确定的影响轮虫产生休眠卵的外源性因素。另外，Ｈｉｎｏｅｔａｔ（１９７６）发现更换培养介质严重影响轮虫混交雌体受精率，Ｈａｇｉｗａｒａｅｌａｌ（１９９４）报道加入细菌可提高轮虫混交雌体受精率。３轮虫休眠卵的葫发轮虫休眠卵的休眠期包括内滞育期和外滞育期。前者指轮虫休眠卵由体内排出后，卵内胚胎仍需缓慢发育一段时间，即受精卵卵内胚胎的“后熟”过程，此问卵对任何外部刺激均不反应，即使在最佳环境下也不能孵化。内滞育期长短由遗传因素决定，也与温度有关，温度越低历时越久。休眠卵在内滞育期主要完成胚外间隙的形成、细胞核数目的增加、外层卵膜的继续加厚等。已完成“后熟”过程的胚胎进入外滞育期，外滞育期的休眠卵已获得在适宜环境中孵化的能力，但在环境条件不合适的情况下将继续保持“休眠”状态。因此，休眠卵的萌发是指在一定环境条件刺激下外滞育期终止，胚胎重新启动发育并最终破膜而出的过程（周利等，２００１）。休眠卵的萌发有不同的形式，休眠卵的萌发率受各种内外因素的影响。３．１轮虫体眠卵的荫发形式据Ｐｏｕｒｒｉｏｔｅｌａｌ（１９８３）的报道，轮虫休眠卵具有分散式孵化和同步式孵化两种基本孵化类型。分散式孵化指一批卵在孵化过程中，幼体的孵出以分散的

白斑综合症病毒（ｗＳｓｖ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中阔宿主的调查研究或零星的方式间隔进行；同步式孵化指一批卵在孵化过程的某一时间内，大量幼体几乎同时孵出。某批卵的孵化表现为何种类型，由多种内外因素决定。一般情况下，休眠卵产生后若不加储存或短暂储存而直接孵化，表现为分散式，这可能因各卵在内因作用下有各不相同的内滞育期和孵前期，或有不同的对环境刺激的敏感水平所致。Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９７４）指出，休眠卵基因型的多样性可能是分散式孵化的主要基础，这种适应性机制可确保该物种在剧变的环境条件下得以延续生存。休眠卵经过一段时间储存后再孵化，则往往表现为同步式，可能因各卵均已度过内滞育期，从而具有近似的对环境刺激的反应能力（周利等，２００１）。３．２影响轮虫休眠卵萌发的因素３．２．１内部因素的影响轮虫休眠卵的萌发率在一定程度上受遗传控制。Ｈａ西ｗａｒａｅｔａｌ（１９９０）发现，取自自然水体中的褶皱臂尾轮虫休眠卵，其萌发率高达９０％以上；而同一品系的轮虫当其在实验状态下连续培养较长时间后，其所产休眠卵的萌发率极显著地下降，这是由于实验状态下轮虫的遗传因子发生变化造成的。３．２．２形成条件的影响由于休眠卵形成时需要大量的营养，所以休眠卵形成时母体的生理状况、环境条件对轮虫休眠卵的萌发力具有较大的影响。席贻龙等（２００１）对不同温度、食物、光照和ｐＨ条件下形成的萼花臂尾轮虫休眠卵进行了萌发研究，结果发现在萌发温度为１５—３０。ｃ范围内，２００Ｃ下形成的休眠卵在２００ｃ的萌发温度下累积萌发率最高；母体以小球藻为食物时，其所产休眠卵的平均累积萌发率显著大于以斜生栅藻或蛋白核小球藻和斜生栅藻混合藻为食物时所产休眠卵的萌发率：ｐＨ６．５和７．５条件下形成的休眠卵的累积萌发率较高。Ｐｏｕｒｒｉｏｔｅｔａｌ（１９８３）Ｌｋ，较了不同食物、温度、光照条件下形成的休眠卵的萌发过程，发现休眠卵形成时的环境因子能影响萌发时的环境因子与萌发率间的相互关系。３５

Ｉ＝］斑综合症病毒（ｗｓ．ｓｖ）的ＰｃＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究Ｂｏｇｏｌｖｏｓｋｙｅｔａｌ（１９６３）发现在酵母（Ｒｈｏｄｏｔｏｎｌａ）和裸藻（Ｅｕｇｌｅｎａ）ｅＰ培养的萼花臂尾轮虫形成的休眠卵萌发率不同，前者为８３％，后者为９６％，且前者萌发速度低于后者。杨家新等（２０００）也发现以小球藻为食物时形成的休眠卵的萌发率高于混和藻组，这是由于不同的食物造成轮虫卵黄营养不同所致。３．２．３储存条件的影响不同的储存条件对轮虫休眠卵的萌发力有较大的影响。如休眠卵在海水介质中保存时，其多孔的表面会遭受细菌侵染，从而可能使孵化率降低（Ｂａｌｏｍｐａｐｕｅｎｇｅｆａｌ，１９９７ｂ；Ｈａｇｉｗａｒａｅｌａ／，１９９７）。另外，在这种保存方式中休眠卵常沉于底部渣滓中，这会减少氧进入卵中，缺氧环境会降低沉渣中休眠卵的生存力（Ｈａｇｉｗａｒａｅｔａｌ，１９８５）。虽然休眠卵也可干燥保存，但“干存法”的孵化率明显低于“水存法”（郑严等，１９７９，２００１），卵内胚胎的水分丧失过多可能是“干存法”效果欠佳的主要原因。Ｈａｇｉｗａｒａｅｌａｌ（１９９７）报道干休眠卵于一３０。Ｃ保存可保持其孵化能力。杨家新等（２０００）认为利用形成休眠卵时的培养液来保存休眠卵是较适宜的办法。当储存时间远远超过内滞育期时，由于卵内胚胎活力的自然衰退，孵化率将随储存期的延长逐渐降低（周利等，２００２）。３．２．４孵化条件的影晌温度是影响轮虫休眠卵萌发率的主要生态因子之一。其对休眠卵萌发率的影响常因种而异，对同种轮虫不同品系间的影响也不相同。如褶皱臂尾轮虫的Ｄｏｒ品系，ｌＯ一１５。Ｃ是其休眠卵的最适萌发温度，之后随萌发温度的升高休眠卵的萌发率呈线性下降（Ｍｉｎｋｏｆｆｅｔａｌ，１９８３）ＩＨａｇｉｗａｒａｅｌａｌ（１９８５）研究的褶皱臂尾轮虫，其休眠卵的萌发率却随着萌发温度的升高而增大。光照对轮虫休眠卵萌发率的影响也因种而异。光对于红臂尾轮虫饵ｒｕｂｅｎｓ）休眠卵的快速、批量萌发是绝对必需的（Ｌｕｂｚｅｎｓ的萌发有益但不是必需的（Ｈａｇｉｗａｒａｅｔｅｌａｌ，１９８０）；对褶皱臂尾轮虫ａｌ，１９８９）；但对角突臂尾轮虫（Ｂ．ａｎｇｕｌａｒｉｓ）和蒲达臂尾轮虫＠ｂｕｄａｐｅｒｓｔｉｎｅｎｓｉｓ）却无影响；对萼花臂尾轮虫休眠卵的萌发并非必要条件（Ｌｕｂｚｅｎｓｅｔａｔ，１９８０；陈菊芳等，】９９８）。光照促进休眠卵萌发的原

白斑综合症瘸（ｗｓｓｖ）的ＰｃＲ检测条件优化及浮游动物中问宿主的调查研究因可能是光照能促进水中过氧化物的产生及胚胎内部脂肪酸的氧化（Ｈａｇｉｗａｒａ８ｆａ１．１９９５ａ）。盐度是影响轮虫休眠卵萌发的重要因子。陈云波等（１９９７）研究了不同盐度对褶皱臂尾轮虫休眠卵孵化的影响，结果轮虫休眠卵在纯水和５０％的高盐度中都不能孵化，在５％～４０％盐度中有不同比例的孵化，且孵化率随着盐度的升高而降低。当孵化水盐度大于休眠卵原水盐度时，孵化率随着盐度的升高而降低，这可能是由于渗透压的变化所致。休眠卵在高盐度的孵化液中，对水的吸收慢，盐度越高，吸水越困难，休眠卵的休眠率就越高。孵化介质也是影响休眠卵孵化的重要环境因子。杨家新等（２０００）、陈菊芳等（１９９８）对萼花臂尾轮虫休眠卵的相关研究发现，改变孵化介质的种类或更新频度均会导致孵化率的改变。刘青等（１９９９）报道适度冷冻可提高褶皱臂尾轮虫、萼花臂尾轮虫和壶状臂尾轮虫的萌发率。这是因为冷冻可软化轮虫休眠卵的卵壳，利于轮虫胚胎破壳而出。另外，休眠卵经适度冷冻其生长抑制剂有可能减少，从而加速了其萌发。但过强的冷冻（一８０。ｃ）会使萌发率降低，因为这种刺激不仅软化了孵壳，而且也破坏了胚胎。另外，在特定条件下形成的轮虫休眠卵，经过一定时间的储藏保存，其萌发率往往有不同程度的降低（Ｂａｌｏｍｐａｐｕｅｎｇｅｌａｌ，１９９７），大量的细菌污染是导致轮虫休眠卵萌发率降低的主要因素之一，使用适宜种类和浓度的消毒剂处理可显著提高其萌发率（Ｂａｌｏｍｐａｐｕｅｎｇｅｌａ４１９９７ｂ；席贻龙等，２００１）。Ｈａｇｉｗａｒａｅｔａｌ（１９９５ａ）报道３２０－－３８０ｎｍ紫外线照射或双氧水处理能诱导轮虫休眠卵的萌发。３．２．５休眠卵的“激活”作用“激活”指通过某种环境刺激“唤醒”卵内的滞育胚胎而使之重新启动发育的过程，但此过程是在孵化抑制因子仍存在的情况下缓慢进行的，其目的是为了使所有待孵化的休眠卵能够在正式转入孵化环境时基本达到同样的胚胎发育阶段，以便尽可能获得快速、同步的孵化效果。周利等（２００２）探讨了介质替换的胚胎“激活”处理对轮虫休眠卵孵化的影响，发现“激活”作用具有促３７

白斑综台症病毒（ｗＳＳＶ）的ＰＣＲ捡测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究使孵化高峰提前到来、增强孵化同步性的双重功效，从而可明显缩短孵育时间，提高孵化速率。４自然永体中轮虫休眠卵的研究概况养殖池塘的底泥中蕴藏着大量的轮虫休眠卵，其数量可达几万一几百万／ｍ２（李永涵等，１９８５）。这些休眠卵在一定条件下萌发、繁衍，是池塘轮虫自然增殖的物质基础，也是集约化培育轮虫的重要“种源”，调查自然水体中的轮虫休眠卵对于生产上开发、利用轮虫资源具有重要意义。调查底泥中的休眠卵是研究自然水体中轮虫休眠卵的常用方法，通过这种方法得到的轮虫休眠卵代表水体中多年来休眠卵的积累。Ｉｔｏ（１９５８）研究了日本１５个池塘褶皱臂尾轮虫休眠卵的密度，发现不同池塘的休眠卵密度差别较大，从很少到９．６６个／ｍ／／１２，但同一池塘中不同底泥深度的休眠卵密度差别不大。Ｓｎｅｌｌｅｔａｌ（１９８３）调查了佛罗里达州Ｔａｍｐａ咸水池塘中褶皱臂尾轮虫休眠卵的密度，发现休眠卵的垂直分布差异显著，表面底泥中休眠卵密度很高（２个／ｍｍ２），随着深度增加休眠卵密度呈指数减小（直至０．２２／ｍｍ２），这与Ｉｔｏ（１９５８）的结果不同。李永涵等（１９８５）从水产养殖的角度研究了我国北方养鱼池塘中轮虫休眠卵的分布特征。陈菊芳等（１９９７）对武汉东湖底泥中轮虫休眠卵的分布和季节变动进行了调查，结果表明异尾轮虫属（Ｔｒｉｃｈａｃｅｒｏａ）、多肢轮虫属（Ｐｏｌｙａｒｔｈｒａ）及多肢拟前翼轮虫属（Ｐｒｏａｌｉｄｅｓ）等主要轮虫属休眠卵数量均呈由底泥表层向底层逐渐递减的趋势，且各属轮虫休眠卵数量亦有明显的季节变动，林里等（１９９７）迸一步研究了武汉东湖轮虫休眠卵的形态。５研究展望从自然水体底泥表面采集的轮虫休眠卵的萌发率达９０％以上，而在室内大规模培养所得的轮虫休眠卵萌发率往往不足５０％（Ｈａｇｉｗａｒａｅｌａｌ，１９９７），探索提高轮虫休眠卵萌发率的最佳条件仍是今后工作的重点。不同种轮虫或同种轮虫的不同品系具有不同的生长潜力，在水产育苗上尽快筛选出适宜于休眠卵批量

白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究生产的轮虫种类和品系是当务之急。另外，轮虫体眠卵表面往往被细菌或其它微生物病原所污染，并可导致养殖经济水生动物的次级感染（席贻龙等，２００１：Ｂａｌｏｍｐａｐｕｅｎｇｅｌ讲，１９９７），那么，病毒可否通过池塘底泥中的轮虫休眠卵进行传播？在ＷＳＳＶ猖獗的今天，加强养殖池塘底泥轮虫休眠卵的研究具有重要意义。参考文献陈菊芳，黄祥飞，周洁。武汉东湖底泥中轮虫休眠卵萌发的研究。暨南大学学报，１９９７，】８（１）：１ｌＯ一１１５陈菊芳，周洁，黄祥飞。萼花臂尾轮虫休眠卵萌发的研究。应用生态学报，１９９８，９（１）：６７—７０陈云波，禹爱民。盐度对褶皱臂尾轮虫存活及其休眠卵孵化的影响。水产科学，１９９７，１６（５）：１２—１６李永函，张东升，赵志牡，赵小爽。池塘习见轮虫休眠卵的形态和鉴定。大连水产学院学报，１９９１：６（１）：１—１１李永涵。养鱼池轮虫休眠卵分布和萌发的研究。水生生物学报，１９８５，９（１）：２０—３０林里，周洁，黄祥飞。武汉东湖若干种轮虫徕眠卵的形态观察。水生生物学报，１９９７，２１（３）：２３４——２４０刘桂云，席贻龙。变温对萼花臂尾轮虫休眠卵形成的影响。安徽师范大学学报，２００２，２５（４）：３６３——３６７刘青，金送笛，刚健，等。冷冻对轮虫体眠卵葫发率的影响。中国水产科学，１９９９，６（４）：３９—４２商占恒，张波。不同温度对小种轮虫产生休眠卵影响的研究。海湖盐与化工，２００３，３２（４）：１８—２０商占恒。不同饵料对轮虫产生休眠卵的影响。海湖盐与化工，２００２，３１（２）：２８－－３０王家楫。中国淡水轮虫志。北京：科学出版社，１９６１．１７—１９王金秋，李德尚。高温高饵料密度对萼花臂尾轮虫实验种群休眠卵动态的影响。应用与环境生物学报，１９９８，４（３）：２６３－－２６６席贻龙ｔ黄祥飞。不同培养条件下萼花臂尾轮虫休眠卵的萌发。动物学报，２００１，４７（３）：

白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究２９２——２９７席贻龙，黄祥Ｅ。两种消毒剂处理对萼花臂尾轮虫休眠卵萌发的影响。中国水产科学，２００１，７（４）：１２２～１２４席贻龙，黄祥飞。食物种类和密度对萼花臂尾轮虫休眠卵形成的影响。动物学报，２０００，４６（１）：２７—３６席贻龙，黄祥飞。温度和食物浓度对萼花臂尾轮虫休眠卵形成的影响。水生生物学报，２０００，２４（２）：１０７—１１３杨家新，黄祥飞。环境因子对萼花臂尾轮虫休眠卵萌发率的影响。水生生物学报，２０００，２４（４）：３３１－－３３９杨家新，黄祥飞。藻类食物对萼花臂尾轮虫繁殖的影响。湖泊科学，１９９８，１０（１）：４２—４８翟宝香，李永函。用电镜对两种轮虫休眠卵卵膜的初步观察。大连水产学院学报，１９８７，２（１）：１９—２７张东升，姜静颖。褶皱臂尾轮虫不同时期休眠卵的超微结构。中国水产科学，１９９９，６（３）：２３－－２７张东升，宋国良，姜静颖。轮虫休眠卵用不同浓度盐溶液处理后卵壳的扫描电镜观察。大连水产学院学报，２００１，１６（２）：１０６—１１１郑严，田风琴，宁立清。褶皱臂尾轮虫ＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｌｉｌｉｓＭｕｌｌｅｒ的繁殖和培养。海洋科学，１９７９，１：２６，３７—３８郑严，周利。轮虫的培养和应用。见：简明中国水产养殖百科全书。北京：中国农业出版社，２００１．９２６－－９３９周利，相建海．郑严。不同年度收存的褶皱臂尾轮虫体眠卵的孵化及滞育胚胎“激活”效果的研究。海洋与湖沼，２００２，３３（６）：６４８－－６５６周利，相建海。关于轮虫休眠卵孵化的若干术语的探讨。海洋科学，．２００１，２５（７）：４７—５ｌＢａｌｏｍｐａｐｕｅｎｇＭＤ，ＨａｇｉｗａｒａＡ，ＮｏｇａｋｉＹ’ｅｔａＬＰｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓｏｆｔｈｅｅｕｒｙｈａｌｉｎｅｒｏｔｉｆｅｒＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ０ＦＭｕｌｌｅｒｂｙｃａｎｎｉｎｇ．Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，１９９７．３５８：１６３—１６６ＢａｌｏｍｐａｐｕｅｎｇＭＤ，ＭｕｎｕｓｗａｍｙＮ，ＨａｇｉｗａｒａＡ，ｅｔａ１．ＥｆｆｅｃｔｏｆｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔｓｏｎｔｈｅｈａｔｃｈｉｎｇｏｆｍａｒｉｎｅｒｏｔｉｆｅｒｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓＭｕｌｌｅｒ．ＡｑｕａｃｕｌｔｕｒｅＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９７ｂ，２８：５５９－－５６５Ｂｅｎ－ＡｍｏｔｚＡ，ＦｉｓｈｌｅｒＲ．ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｓｅｘｕａｌｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｔｉｃａｔｉｌｉｓｂｙａｄｉｅｔｏｆｓａｌｔ—ｇｒｏｗｎＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓｏｃｕｌａｔａ．ＭａｒｉｎｅＢｉｏｌｏｇｙ，１９８２，６７：２８９－－２９４

自斑综台症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ榆测条件优化及浮游动物中间宿主的调煎研究ＢｏｇｏｉｖｏｓｋｙＡＳ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓｔｏｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓｏｆｒｏｔｉｆｅｒｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ１ＢｙｕｌｌＭｏｓｋＯｂｓｈｃｈＩｓｐｙｔＰｒｉｒ，１９６３．６８：５０一６７ＣｌｅｍｅｎｔＰ，ＰｏｕｒｒｉｏｔＲ．ＡｂｏｕｔａｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｔｈｒｏｕｇｈｓｅｖｅｒａｌｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｉｎａｃｌｏｎｅｏｆｔｈｅｒｏｔｉｆｅｒＮｏｔｏｒａｍａｔａ６０ｐｅｕｓ．Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，Ｉ９８０．７３：２７—３１Ｃ）ｅｍｅｎｔＰ＇ＰｏｕｒｒｉｏｔＲ，ＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｎｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｍｉｃｔｉｅｒｅａｃｔｉｏｎｉｎａｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃｃｌｏｎｅｏｆＮｏｔｏｍｍａｔａｃｏｐｅｕｓ．ＡｒｃｈＨｙｄｒｏｂｉｏｌＢｅｉｈ，１９７７，８：２０５－－２０６ＧｉｌｂｅｒｔＪＪ．ＤｏｒｍａｎｃｙｉｎＲｏｔｉｆｅｒｓ．ＴｒａｎｓＡｍｅｒＭｉｃｒｏｓＳｏｃ，１９７４，９３（４）：４９０－－５１３ＧｉｌｂｅｒｔＪＪ．Ｓｐｅｃｉｅｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓｉｎｔｈｅｒｏｔｉｆｅｒｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ，１９７８，９７（３）：３３０－－３３９ＨａｇｉｗａｒａＡ，ＢａｌｏｍｐａｐｕｅｎｇｔｈｅｒｅｓｔｉｎｇＡｓｐｌａｎｃｈｎａ．ＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓＭＤ＇ＭｕｎｕｓｗａｍｙＮ，ｅｌ醴ＭａｓｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｅｇｇｓｏｆｔｈｅｅｕｒｙｈａｌｉｎｅｒｏｔｉｆｅｒＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｅａｔｉｌｉｓａｎｄ且ｒｕｔｕｎｄｉｆｏｒｍｉｓ．Ａｑｕａｅｕｌｔｕｒｅ，１９９７，１５５：２２３－－２３０ＨａｇｉｗａｒａＡ，ＧａｌｌａｒｄｏＷＧＡｓｓａｖａａｒｅｅＭ，ｅｌａ１．Ｌｉｖｅｆ００ｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＪａｐａｎ：ｒｅｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓａｎｄｆｕｔｕｒｅａｓｐｅｃｔｓ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２００１，２００：１１１—１２７ＨａｇｉｗａｒａＡ，ＨａｍａｄａＫ，ＨｏｆｉＳ，ｅｔａ１．ＩｎｃｒｅａｓｅｄｓｅｘｕａｌｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ（Ｒｏｔｉｆｅｒａ）ｗｉｔｈ１８１：１—８ｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｒｏｔｉｆｅｒｅｘｔｒａｃｔｓ．ＪＥｅｐＭａｒＢｉｏｌＥｃｏｌ，１９９４，ＨａｇｉｗａｒａＡ，ＨｉｎｏＡ，ＨｉｒａｎｏＲ．ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｒｅｓｔｉｎｇｓｔｏｃｋｓｏｆｔｈｅｒｏｔｉｆｅｒＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ．ＮｉｐｐｏｎｅｇｇｆｏｒｍａｔｉｏｎａｍｏｎｇｆｉｖｅＪａｐａｎｅｓｅＳｕｉｓａｎＧａｋｋａｉｓｈｉ，１９８８ｂ，５４（４）：５７７—５８０ＨａｇｉｗａｒａＡ，ＨｉｎｏＡ，ＨｉｒａｎｏＲ，Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｃｂｌｏｒｉｎｉｔｙｏｎｒｅｓｔｉｎｇｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｒｏｔｉｆｅｒ（Ｂｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｅａｔｉｌｉｓ）．ＮｉｐｐｏｎＳｕｉｓａｎＧａｋｋａｉｓｈｉ，１９８８ａ，５４｛：４）：５６９－－５７５ＨａｇｉｗａｒａＡ，ＨｉｎｏＡ．Ｆｅｅｄｉｎｇｈｉｓｔｏｒｙａｎｄｈａｔｃｈｉｎｇｏｆｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓｉｎｔｈｅｍａｒｉｎｅｒｏｔｉ危ｒＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ．ＮｉｐｐｏｎＳｕｉｓａｎＧａｋｋａｉｓｈｉ，１９９０，５６：１９６５—１９７１ＨａｇｉｗａｒａＡ，ＨｉｎｏＨ，ＨｉｒａｎｏＲ．ＣｏｍｂｉｎｅｄｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅｈａｓｈｉｎｇｏｆｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄｅｇｇｓｏｆｔｈｅｒｏｔｉｆｅｒＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍＮｉｐｐｏｎＳｕｉｓａｎＧａｋｋａｉｓｈｉ，１９８５，５１（５）：７５５－－７５８ＨａｇｉｗａｒａＡ。ＨｉｎｏＨ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｃｕｂａｔｉｏｎａｎｄｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｎａ｜ｌｏｕｔｄｏｏｒｐｏｎｄ．ｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｈａｔｃｈｉｎｇａｎｄｍｉｘｉｓｉｎｔｈｅｄｅｒｉｖｅｄｃｌｏｎｅｓｏｆｔｈｅｒｏｔｉｆｅｒＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｅａｔｉｌｉｓ．Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，１９８９，１８６／１８７：４１５—４２１ＨａｇｉｗａｒａＡ，ＨｏｓｈｉＮ，ＫａｗａｈａｒａＦ＇ｅｔａｌ．ＲｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓｏｆｔｈｅｍａｒｉｎｅｒｏｔｉｆｅｒＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓＭｕｌｌｅｒ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄｅｆｆｅｃｔｏｆｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ３１３—３１４：２２３－－２２９ＨａｇｉｗａｒａＡ，ＬｅｅＣＳ．Ｒｅｓｔｉｎｇｕｎｄｅｒｏｎｈａｔｃｈｉｎｇ．Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，１９９５ａ，ｅｇｇｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＬ－ａｎＳ—ｔＹｐｅｒｏｔｉｆｅｒＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｗａｔｅｒｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．１９９１，５７（９）：】６４５一】６５０４ｌ

臼斑综合症嫡毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ榆测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究ＨｉｎｏＡ，ＨｉｒａｎｏＲＥｃｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｂｉｓｅｘｕａｌｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｒｏｔｉｆｅｒＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ：１．Ｇｅｎｅｒａｌａｓｐｅｃｔｓｏｆｂｉｓｅｘｕａｌｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｄｕｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ．ＮｉｐｐｏｎＳｕｉｓａｎＧａｋｋａｓｉｈｉ，１９７６，４２：１０９３－－１０９９ＨｉｎｏＡ，ＨｉｒａｎｏＲ．ＥｃｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｂｉｓｅｘｕａｌｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｒｏｔｉｆｅｒＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ－－１１．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｕｍｕｌａｔｉｖｅｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＢｕｌｌＪａｐＳｏｃＳｃｉｅｎｔＦｉｓｈ．１９７７．４３：１１４７一１１５５ｌｍａｎｕｒａＳ，ＡｓｈｉｄａｔｅＳ，ＴｏｊｏＨ．ＭａｓｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｆｌｉｓｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓｗｉｔｈａｓｔｉｍｕｌｕｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．ＴｅｃｈＲｅｐＪａｐＳｅａＲａｎｃｈｉｎｇＰｒｏｇｒａｍｓ，１９７９，８：５３—６ｌＩｔｏｔＳｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅ‘Ｍｉｚｕｋａｗａｒｉ’ｉｎｅｅｌ－ｃｕｌｔｕｒｅｐｏｎｄｓ．１０．Ｔｈｅｄｅｎｓｉｔｙｏｆｄｏｒｍａｎｔｅｇｇｓｏｆｒｏｔｉｆｅｒｏｎｂｏｔｔｏｍｄｅｐｏｓｉｔｓｉｎｅｅｌ—ｃｕｌｔｕｒｅｐｏｎｄｓ．ＲｅｐＦａｃＦｉｓｈＰｒｅｆｅｃｔＵｎｉｖＭｉｅ，１９５８，３：】７０—１７７ＬｕｂｒｅｎｓＥ，ＦｉｓｈｉｅｒＲ，Ｂｅｒｄｕｇｏ—ＷｈｉｔｅＶ．１ｎｄｕｃｔｉｏｎｈｏｆｓｅｘｕａｌｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓｒｅａｌ＿ｅｄｉｎｓｅａｗａｔｅｒ．Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，１９８０．７３：５５—５８ＬｕｂｚｅｎｓＥＧＭｉｎｋｏｆｆＧ，Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅａｇｅｏｆｔｈｅａｌｇａｅｆｅｄｔｏｒｏｔｉｆｅｒｓ（Ｂｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ０ＦＭｕｌｌｅｒ）ｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉｘｉｓｉｎｔｈｅｉｒｐｒｏｇｅｎｉｅｓ．Ｏｅｅｏｌｏｇｉａ（Ｂｅｒｌｉｎ），１９８８，７５：４３０—４３５ＭｉｎｋｏｆｆＱＬｕｂｚｅｎｓＥ，ＫａｈａｎＤ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｇｈａｔｃｈｉｎｇｏｆｍｔｉｆｅｒ（Ｂｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ）ｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓ．Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，１９８３，１０４：６１－－７０ＰｏｕｒｒｉｏｔＲ，ＳｎｅｌｌＴＷＲｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓｏｆｒｏｔｉｆｅｒｓ．Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，１９８３．１０４：２１３－－２２４ＰｏｚｕｅｌｏＭ，ＬｕｂｉａｎＬＭ．ＡｓｅｘｕａｌａｎｄｓｅｘｕａｌｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｒｏｔｉｆｅｒＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓｃｕｌｔｕｒｅｄａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔＳａｌｉｎｉｔｉｅｓ．Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，１９９３，２５５／２５６：１３９—１４４ＳｎｅｌｌＴｗ，ＨｏｆｆＦＨＦｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｍａｌｅｆｅｒｔｉｌｉｔｙｉｎｔｈｅｒｏｔｉｆｅｒＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ．Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，】９８７，１４７：３２９－－３３４ＳｎｅｌｌＴ’ＢｕｒｋｅＢＬ，ＭｅｓｓｕｒＳＤ．ＳｉｚｅａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓｉｎａｎａｔｕｒａｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ．ＧｕｌｆＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｐｏｒｔｓ，１９８３，７：２８５－－２８７ＷｕｒｄａｋＥＳ，ＧｉｌｂｅｒｔＪＪ，ＪａｇｅｌｓＲ．ＦｉｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｒｅｓｔｉｎｇｅｇｇｓｏｆｔｈｅｒｏｔｉｆｅｒｓＢｒａｃｈｉｏｎｕｓｃａｔｙｃｉｆｌｏＭｓａｎｄＡｓｐｌａｎｃｈｎａｓｉｅｂｏｌｄｉ．ＴｒａｎｓＡｍＭｉｃｒｏｓｃＳｏｅ，１９７８，９７：４９—７２

白斑综合症病毒（螂ｖ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动糖中间宿主的调查研究第二章检测方法的建立Ｃｈａｐｔｅｒ２ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＤｅｔｅｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓ４３４

白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究（一）ＰＣＲ－核酸探针斑点杂交法检测白斑综台症病毒（ＷＳＳＶ）ＷｈｉｔｅＳｐｏｔＳｙｎｄｒｏｍｅＶｉｒｕｓ（ｗｓｓｖ）ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｔｉｏｎ（ＰＣＲ）－ＤｏｔＢｌｏｔＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ摘要：设计了２对引物用于检测对虾白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ），外引物用于ＰＣＲ扩增，内引物用于合成探针进行斑点杂交。结果表明，外引物ＰＣＲ一电泳的检出极限为ｌｐｇＷＳＳＶＩ）ＮＡ；ＰＣＲ产物经内探针斑点杂交，可检出ｌＯｆｇ的ＷＳＳＶＤＮＡ：单纯的内探针斑点杂交只能检测出ｌｎｇ以上的ＷＳＳＶＤＮＡ。ＰＣＲ－斑点杂交的检测灵敏度比ＰＣＲ一电泳高２个数量级，比单纯斑点杂交高５个数量级。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明，ＰＣＲ一斑点杂交检测ＷＳＳＶ特募、可靠，该方法可用于痕量ＷＳＳＶ的检测。关键词：ＰＣＲ；斑点杂交；白斑综合症病毒Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｗｏＤａｊｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｆｏｒｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｏｕｔｅｒｏｎｅｗｓｓｆｏｒｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ），ｔｈｅｉｎｎｅｒｏｎｅｗａｓｆｏｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐｒｏｂｅ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆｏｕｔｅｒｐｒ｛ｍｅｒｓＰＣＲ－ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｉｓｉｓｗａｓｌｐｇＷＳＳＶＤＮＡ，ｗｈｉｃｈｗａｓ１０ｆｇＷＳＳＶＤＮＡｉｎＰＣＲ－ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＳｉｎｇｌｅｉｎｎｅｒｐｒｉｍｅｒｓｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｃｏｕｌｄｏｎｌｙｄｅｔｅｃｔｍｏｒｅｔｈａｎｌｎｇＷＳＳＶＤＮＡ．ＴｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆＰＣＲ—ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗａｓ１０２ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎＰＣＲ－ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｉｓｉｓ．１０’ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｓｉｎｇｌｅｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．ＴｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆＰＣＲ－ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＳｏｕｔｈｅｒｎｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＰＣＲ·ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗａｓｓｕｉｔｆｏｒｔｒａｃｅＷＳＳＶｄｅｔｅｆｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ；ｄｏｔ－ｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ白斑综合症病毒（Ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ，ＷＳＳＶ）自１９９２．１９９３年在亚洲东部出现后，在亚洲及印度一太平洋的几乎所有对虾养殖地区迅速传播开来，每年造成对虾大量死亡，给生产带来巨大损失，是迄今为止危害最为严重的一种对虾病毒（Ｌｉｇｈｔｎｅｒ１９９９）。目前，分子生物学的核酸探针技术及ＰＣＲ技术都奉节内容已发表于Ｅ】收录期刊《高技术通迅》２００４年第３期

自斑综台症病毒（ｗｓｓｖ）的ＰｃＲ捡测条件优化艘浮游动物中问宿主的调查研究已应用到白斑综合症病毒的检测（夏春等，１９９９；谢数涛等，２００１；雷质文等，２００２；史成银等，２００２；Ｋｉｍｅｌａｌ，１９９８；ＴａｎｇＫａｔｈｙｅｌａｌ，２０００）。核酸探针斑点杂交分析法检测对虾病毒不需提取ＤＮＡ，所需试剂和仪器简单，且一次可对大量样品ｆ可达上百个）进行测定，易于推广，目前核酸探针点杂交试剂盒已实现商品化并得到广泛应用。但是，因单纯的核酸探针斑点杂交是直接检测存在于病虾体内的ＷＳＳＶＤＮＡ，故灵敏度较低。ＰＣＲ方法对病毒ＤＮＡ进行了大量扩增，故其灵敏度高于斑点杂交，但常规ＰＣＲ．电泳检测过程处理样品量少，效率较低，而且由于样品中的ＤＮＡ来源复杂等原因，可能出现假阳性和假阴性。在实验研究中，我们探讨了将ＰＣＲ与核酸探针方法结合起来，先对样品ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，再用内探针进行斑点杂交，则检测的灵敏度和可靠性都会提高，该方法可用于痕量ＷＳＳＶ的检测。１材料与方法１．１引物的设计根据ｗＳＳＶＤＮＡ序列，利用软件ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０设计了两对引物。用于样品ＤＮＡ扩增的外引物为５’一ＣＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＴＡＧＣＧＧＡＴＡ一３，（０１）和５’一ＧＡＣＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＧＡＡＴＴＡＣ一３’（０２），该对引物的产物长度２３５ｂｐ；用于合成核酸探针的内引物为５’一ＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＴＡＣＧｃＡＧＴＧＡ一３’（】１）和５’一ＧＴＴＣＴＡＧＧＧＣＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣ－－３’（１２），产物长度为１０ｌｂｐ。在ＧｅｎＢａｎｋ上经Ｉ？，ＬＡＳＴ比较，与网上的ＷＳＳＶ碱基序列１００％配对，与其他物种的基因序列同源性很低。１．２样品的ＰＯＲ扩增及检出灵敏度每２５１．ｔｌ反应体系中加灭菌水１３．７５ｐｌ，１０ｘＢｕｆｆｅｒ２．５Ｉ－ｔｌ，２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２２．０１ａｌ，用ｄＵＴＰ取代ｄＴＴＰ的ｄＮＴＰ混合物２．５ｐａｌ（其中ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ和ｄＧＴＰ各２ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＵＴＰ４ｍｍｏｌ／Ｌ），尿嘧啶一ＤＮＡ糖基酶（ｔｒＮＧ）０．５９ｌ，１０ｒｔｍｏｌＦＬ引物混和物２．５ｐ，１，５Ｕ／Ｉ．ｔｌＴａｑ酶０．２５９ｌ，模板１山。４５

白斑综合症病毒（ｗｓｓｖ）的ＰＣＲ检测条件优化及浮游动物中间宿主的调查研究ＰＣＲ反应程序为３７℃ｌＯｍｉｎ进行ＬＩＮＧ消化，９５℃１０ｍｉｎ灭活ＬＩＮＧ，１个循环；９５℃３０ｓ，５４。Ｃ３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃５ｍｉｎ，１个循环。扩增结束后，经１．５％琼脂糖电泳检查结果。ＰＣＲ检测灵敏度的确定采用模板１０倍稀释法。以ＷＳＳＶＤＮＡ为模板，按ｌｏ倍稀释设１０ｎｇ／ｕｌ＿＿ｏ．Ｉｆｇ／ｒｄ９个梯度ｉｌｏ，１，ｏ，ｌ，ｏ．０１ｎｇ／ｇｌ；１，ｏ．１，ｏ．Ｏｌｐｓ／ｌａｌ；ｌ，Ｏ．１彰ｕ１），每２５ｐ．１反应体系中加ｌ山模板，以灭菌水为阴性对照。扩增产物经１．５％琼脂糖电泳，能出现电泳条带的最低模板量定为ＰＣＲ检测的最低极限。１．３ＰＣＲ法合成核酸探针按ＤｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎＬａｂｅｌｉｎｇＭｉｘ（Ｒｏｅｂｅ）的使用说明用ＰＣＲ法合成ＤＩＧ标记的核酸探针。每１００ｌ＿ｔｌ反应体系中含灭菌水５０ｐｌ，１０ｘｂｕｆｆｅｒ１０９ｌ，２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２６ｐ．１，ＰＣＲＤＩＧｌａｂｅｌｉｎｇｍｉｘｌＯｐ．１，５Ｈｍｏｌ／Ｌ引物混和物２０１ａｌ，１５ｎｇ／ｇｌＷＳＳＶＤＮＡ３９ｌ。混匀后，进行一个热启动（９４。Ｃ，１０ｍｉｎ：５５。Ｃ，５ｒａｉｎ）。加入５Ｕ／９１１铀酶ｌｕｌ，进行３０个循环（９４０Ｃ，３０ｓ：５０．１。Ｃ，３０ｓ：７２０Ｃ，】ｍｉｎ）：７２。Ｃ５ｍｉｎ后４０Ｃ保存。取ｌｇｌＰＣＲ产物，加上样液５¨】，在２％琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察照相。其余９９１ｘｌ中加入２０ｍｇ／ｍｌｌＧｌｙｃｏｇｅｎｌｇｌ，２００ｒａＭＥＤＴＡｌＯｇｌ，４ＭＬｉＣＩｌ！ａｌ，冰无水乙醇３６０肛１，充分混和；－－７０。Ｃ保存ｌｈ，４０Ｃ１３０００８离心３０ｍｉｒａ用７０％冰乙醇０．５ｍｌ洗沉淀物，４０ｃｔ３０００９离心１０ｍｉｎ，沉淀自然晾干后加入５０Ｉ＿ｔｌＴＥ溶解。按ＤＩＧＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ试剂盒（Ｒｏｃｈｅ）说明检测探针产量，然后按２ｎｇ／ｐ．１分装，置－－２０。Ｃ冰箱备用。１．４ＷＳＳｖＤＮＡ的提取ＥＤＴＡ、５０９９／ｍｌ按经典方法提取ＷＳＳＶＤＮＡ：纯化的病毒悬液经２０ｍｍｏｌ／Ｌ蛋白酶Ｋ，Ｏ．５％ＳＤＳ５６＂Ｃ孵育３ｈ，用等体积的酚／氯仿／异戍醇（２５：２４：１）抽提２次，乙醇沉淀，晾干后的ＤＮＡ溶于ＴＥ缓冲液（金冬雁等，１９９２）。１．５用核酸探针斑点杂交分析法检测ＰＣＲ产物ＰＣＲ产物在ＰＣＲ仪上９５。Ｃ变性１０ｍｉｎ，每样取１“ｌ点样于硝酸纤维素膜上，８０。Ｃ交联２ｈ后，在预杂交液中６５。ｃ孵育Ｏ．５—２ｈ，加入变性的ＤＩＧ标记探针，

白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的ＰＣＲ检测条件优化投浮游动物中闻宿主的调查研究于６５。ｃ孵育６—１６ｈ；２×ＳＳＣ／Ｏ．１％ＳＤＳ，Ｏ．１ｘＳＳＣ／Ｏ．１％ＳＤＳ洗膜；膜在碱性磷酸酶标记的ＤＩＧ抗体缓冲液中振荡３０ｍｉｎ，以ＮＢＴ／ＢＣＩＰ为底物显色（史成银等，１９９９）。１．６Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测ＰＣＲ产物外引物的ＰｅＲ产物经１．５％琼脂糖电泳后，利用毛缀管作用将ＤＮＡ转移至尼龙膜，然后用内据针杂交（金冬雁等，１９９２）ｊ杂交步骤ｌ可斑点杂交，只是因尼龙膜带电荷，故可用紫外交联将ＤＮＡ固定于膜上。２结果与分析２．１外引物ＰＣＲ一电泳检测灵敏度分析外弓１物ＰＣＲ一电泳检测灵敏度示于图】。由图可见，１０ｎｇ一１ｐｇ的模板在２３５ｂｐ处可明显看到扩增的条带，Ｏ．１ｐｇ—０，ｌｆｇ的模板量的扩增结果无条带出现，说明ＰＣＲ－电泳检测ＷＳＳＶＤＮＡ的检出极限为ｌｐｇ。２。２ＤＩＧ标记探针的ＰＣＲ法制备及其产量测定ＰＣＲ法合成的ＤＮＡ探针电泳带大于１０１ｂｐ（图２），表明ＤＩＧ．１１．ｄＵＴＰ已成功嵌入，因它在探针中比ｄＴＴＰ分子量大。合成的探针经提纯后检测，产量为８０ｎｇ／ｔ－ｔｌ。４７