2024年3月26日发(作者：)

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２００７年ｌ２月　

第ｌ７卷第ｌ２期　

中国比较医学杂志　

ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　

Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２０ｏ７　

Ｖｏ１．１７　Ｎｏ．１２　

）　

研究报告￥　

嘧、嗡、嗡　、　

磷酸二酯酶５选择性抑制剂ｚａｐｒｉｎａｓｔ　

对小鼠卵母细胞成熟的影响　

ｆ、淑敏，张　颢，季　刚　

（首都体育学院科研处重点实验室，北京　１０００８８）　

【摘要】　目的

响。方法

研究磷酸二酯酶５（ＰＤＥ５）选择性抑制剂扎普司托（ｚａｐｒｉｎａｓｔ）对小鼠卵母细胞体外成熟的影　

采用小鼠卵母细胞自发成熟、促卵泡刺激素（ＦＳＨ）诱导次黄嘌呤（ＨＸ）阻滞成熟以及卵泡卵母细胞成熟　

三种体外培养模型。结果　１０／￣ｍｏｌ／Ｌ的ｚａｐｒｉｎａｓｔ不仅能显著抑制小鼠卵丘卵母细胞复合体（ＣＯＣｓ）和裸卵（Ｄ０ｓ）的　

自发成熟（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１），而且还能显著抑制ＦＳＨ对ＨＸ阻滞的ＣＯＣｓ的以及卵泡卵母细胞成熟的促进效应（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１）。　

结论ＰＤＥ５能促进小鼠卵母细胞的体外成熟。　

【关键词ｌ　磷酸二酯酶；ｃＡＭＰ；ｃＧＭＰ；卵母细胞；小鼠　

【中图分类号ｌ　Ｑ４９２．５　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６７１．７８５６（２００７）１２—０７０２．０４　

Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ　Ｔｙｐｅ－５　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｎ　Ｍｏｕｓｅ　

Ｏｏｃｙｔｅ　Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　

ＢＯ　Ｓｈｕ—ｍｉｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｈａｏ，ＪＩ　Ｇａｎｇ　

（Ｃａｐｉｔａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８８，Ｃｈｉｎａ）　

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ＰＤＥ５　ｏｎ　ｍｏｕｓｅ　ｏｏｃｙｔｅ　ｍａｔｕｒａｔ’ｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．　

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｕｓｅ　ｃｕｍｕｌｕｓ—ｏｏｃｙｔｅ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ（ＣＯＣｓ）ｏｒ　ｄｅｎｕｄｅｄ　ｏｏｃｙｔｅｓ（ＤＯｓ）ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　

ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ＰＤＥ５　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｇｅｒｍｉｎａｌ　ｖｅｓｉｃａｌ　ｂｒｅａｋｄｏｗｎ（ＧＶＢＤ）ａｎｄ　ｆｉｒｓｔ　ｐｏｌａｒ　ｂｏｄｙ（ＰＢ１）　

ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ｅｎｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ．ａ　ｍｏｕｓｅ　ｆｏｌｌｉｃｌｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｏｄｅｌ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｕｓｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｉｎ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　

ｏｏｃｙｔｅｓ，ＰＤＥ５　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｚａｐｒｉｎａｓｔ　ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｂｏｔｈ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｏｏｃｙｔｅ　ｍｅｉｏｔｉｃ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＦＳＨ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ＨＸ—ａｒｒｅｓｔｅｄ　

ｍｅｉｏｔｉｃ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｒｅａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｙｐｅ　５　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｈｅ　ｆｏｌｌｉｃｌｅ—ｅｎｃｌｏｓｅｄ　ｏｏｃｙｔｅ　

ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＦＳＨ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｕｇｇｅｓｔ　ｔｈａｔ　ＰＤＥ５　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｍｏｕｓｅ　ｏｏｃｙｔｅ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．　

【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】ＰＤＥ；ｃＡＭＰ；ｃＧＭＰ；Ｏｏｃｙｔｅｓ；Ｍｉｃｅ　

哺乳动物卵母细胞在排卵前促性腺激素峰到来　子以及生长因子的调节，这些细胞外信息分子多为　

前，一直被阻滞在第一次减数分裂的前期，但在体外　

能够自发成熟。已知卵母细胞成熟是一个由外界信　

号诱导产生的细胞周期转换过程，细胞外信号最终　

膜信号，必须先作用于细胞膜上的受体，改变细胞内　

第二信使的浓度，引发一系列级联放大反应，最终通　

过某些蛋白质的磷酸化来实现其功能调节作用…。　

虽然ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３、ＤＧ、ｃａ２　等第二信使都参与　

哺乳动物卵母细胞成熟的调控，但只有ｃＧＭＰ和／或　

ｃＡＭＰ的动态变化对哺乳动物卵母细胞减数分裂的　

引起细胞内基因转录及蛋白质合成，中间具有复杂　

的信号转导通路。卵母细胞的成熟受激素、细胞因　

【基金项目】北京市教委科技发展规划资助项目（编号：ＫＭ２００７１００２９００１）。　

【作者筒介】ｈ淑敏（１９６７一），女，博士后，副教授。主要研究方向：生理学。　

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中国比较医学杂志２００７年１２月第１７卷第１２期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｏｍｐ　Ｍｅｄ，Ｄｅｃｅｍ￣ｒ　２００７，Ｖｏ１．１７．Ｎ。．１２　７０３　

阻滞和恢复起决定性作用　Ｊ。　

磷酸二酯酶（ＰＤＥ）是一类水解细胞内ｃＡＭＰ　

和，或ｃＧＭＰ的同功酶，其生理功能就是维持细胞内　

ｃＡＭＰ和，或ｃＧＭＰ动态变化。虽然目前发现的ＰＤＥｓ　

有１１种，但在卵巢中表达的只有４种，即ＰＤＥ３、　

ＰＤＥ４、ＰＤＥ５和ＰＤＥ８　，提示这４种ＰＤＥ与卵巢功能　

息息相关。ＰＤＥ５是一类参与调节ｃＧＭＰ．特异性信　

号通路的关键酶，使用其选择性抑制剂抑制其活性　

能降低细胞中的ｃＧＭＰ水平　。有关ｃＡＭＰ．特异酶　

（如ＰＤＥ３、ＰＤＥ４）抑制剂对哺乳动物卵母细胞成熟　

影响的报道已很多，但未见ＰＤＥ５抑制剂对哺乳动　

物卵母细胞减数分裂阻滞和恢复影响的研究报　

道　。为此，我们采用已建立的自发成熟、促性腺　

激素诱导的ＨＸ阻滞成熟以及卵泡卵母细胞成熟３　

种模型，研究了ＰＤＥ５选择性抑制剂扎普司托　

（ｚａｐｒｉｎａＳｔ）对小鼠卵母细胞体外成熟的影响。本研　

究可望为揭示环核苷酸第二信使调控哺乳动物卵母　

细胞减数分裂阻滞和恢复的机制提供参考数据。　

１材料和方法　

１．１主要试剂和配制　

Ｍ．１９９培养基和丙酮酸钠为ＧＩＢＣＯ公司产品；　

ＰＭＳＧ购白天津实验动物中心；Ｇｉｎ、ＨＸ、牛血清白蛋　

白Ｖ片段（ＢＳＡ）、ｚａｐｆｉｎａｓｔ等主要试剂为Ｓｉｇｍａ公司　

产品。其中，将ｚａｐ￣ｎａｓｔ溶解在ＤＭＳＯ中，终浓度为　

１０　ｍｍｏｌ／Ｌ左右，配好后一２０℃保存。临用前将其稀　

释至所需的浓度，ＤＭＳＯ在培养基中的终浓度不能　

超过０．１％。　

１．２　实验动物　

２４～２６　ｄ的性未成熟昆明白小鼠，体重１４～１６　

ｇ，购自维通利华实验动物有限公司。合格证号：　

ｓｃｘＫ（京）２００２—０００３，自由采食与饮水，室温饲养２～　

３　ｄ后，每只腹腔注射ｌ０　ＩＵ　ＰＭＳＧ。　

ｌ－３卵母细胞的采集和培养　

注射ＰＭＳＧ　４６　ｈ后，颈椎脱臼法处死小鼠，剖开　

腹腔取出卵巢，放于含有４　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＸ的Ｍ１９９培养　

液（其中含有０．３％ＢＳＡ，２　ｎｕｎｏｌ／Ｌ　Ｇｉｎ，０．２３　ｍｍｏｌ／Ｌ　

丙酮酸钠，１×１０　ＩＵ／Ｌ青、链霉素，此培养液定名为　

ＨＸ培养液）中，在体视显微镜下，用灭菌５号半注　

射针头穿刺大的有腔卵泡，释放ＣＯＣｓ。选择包裹３　

～

５层卵丘细胞的ＣＯＣｓ，在３７℃的ＨＸ培养液中洗　

３　次。ＤＯｓ是用口径略大于卵母细胞直径的捡卵管　

轻轻吹打ＣＯＣｓ几次获得。ＣＯＣｓ和ＤＯｓ分别以４０～　

５０枚，孑Ｌ的密度培养于含有不同药物的四孑Ｌ培养板　

（Ｎｕｎｃ公司）内，每孑Ｌ含１．０　ｍＬ成熟培养液，在　

３７℃、５％Ｃ（）２、饱和湿度的ＣＯ　培养箱内培养不同　

的时间。培养结束后，在体视显微镜下观察卵母细　

胞减数分裂的情况。　

１．４卵泡的分离和培养　

颈椎脱臼法处死小鼠后，从背部迅速取出卵巢　

放入预先平衡过的ＭＥＭ培养液中，其中含有０．３％　

ＢＳＡ、２　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌ．Ｇｌｎ、０．２３　ｍｍｏｌ／Ｌ丙酮酸钠、５￣ｇ／ｍＬ　

转铁蛋白、５￣ｇ／ｍＬ胰岛素。用无菌针头机械分离大　

的有腔卵泡。选择直径在２００～３５０　ｍ膜细胞完整　

的透亮卵泡，单个接种在９６孑Ｌ　Ｎｕｎｃ培养板中。根　

据实验设计，每孑Ｌ含有不同浓度药物的培养液０．１　

ｍＬ，在３７℃、５％Ｃ（）２、饱和湿度的ＣＯ　培养箱内培　

养２４　ｈ。培养结束后，在体视显微镜下用针头挑破　

卵泡腔，暴露卵母细胞，观察卵母细胞减数分裂的情　

况。　‘　

１．５　卵母细胞成熟的判断标准　

以生发泡破裂（ｇｅ￣ｉｎＭ　ｖｅｓｉｃｌｅ　ｂｒｅａｋｄｏ￣，　

ＧＶＢＤ）代表卵母细胞的核成熟，第一极体（　ｒｓｔ　ｐｏ１ａｒ　

ｂｏｄｙ，ＰＢＩ）排出代表减数分裂的完成，卵母细胞细　

胞质发黄判断为退化或死亡。　

１．６统计学方法　

每组实验均重复３次，结果以均值±标准差（元　

±ｓ）表示，ｔ检验，Ｐ＜０．０５差异有显著性，Ｐ＜　

０．０ｌ差异有极显著性。　

２　结果　

２．１　ｚａｐｄｎａｓｔ对小鼠卵母细胞自发成熟的影响　

ＣＯＣｓ和ＤＯｓ分别在含有１０￣ｍｏｌ／Ｌ浓度的　

ＰＤＥ５抑制剂ｚａｐｆｉｎａｓｔ的成熟培养液中，培养２４　ｈ后　

的减数分裂情况见图１。　

２．２　ｚａｐｄｎａｓｔ对ＦＳＨ诱导的ＨＸ阻滞的小鼠卵母　

细胞成熟的影响　

将ＣＯＣｓ培养在含ＦＳＨ（５０　ＩＵＬ）或ｚａｐｆｉｎ￣ｔ的　

ＨＸ培养液中，２４　ｈ后结束培养，卵母细胞减数分裂　

情况分别见图２。由图２可知，ｚａｐｆｉｎ￣ｔ能显著抑制　

ＦＳＨ对ＨＸ阻滞的小鼠ＣＯＣｓ成熟的促进作用。　

２．３　ｚａｐｄｎａｓｔ对小鼠卵泡卵母细胞成熟的影响　

将未用ＰＭＳＧ处理的，直径为２５０～３５０　ｍ的小　

鼠卵泡（图３Ａ，Ｂ）分别培养在ＭＥＭ培养基（对　

照）、含有ｚ￣ｆｉｎａｓｔ的ＭＥＭ培养基、含有　Ｈ的　

ＭＥＭ培养基以及含有　Ｈ＋ｚａｐｆｉｎ￣ｔ的ＭＥＭ培养　

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７０４　中国比较医学杂志２００７年１２，Ｅｌ第１７卷第１２期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｏｍｐ　Ｍｅｄ

Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　２００７．Ｖ０１．１７．Ｎ０．１２　

，

基中，２４　ｈ后结束培养，卵母细胞的减数分裂情况见　

图４。由图４可知，单加ＦＳＨ能显著促进卵泡卵母　

应。此外，单加ｚａｐｒｉｎａｓｔ对卵泡卵母细胞的成熟虽　

异。　

∞　如　柏　如　加　ｍ　０　

静糠镁　

＾　ｖ器甍ｇ０　Ｑ∞霉口８墨　

有一定的抑制作用，但与对照组相比，未见统计学差　

细胞的成熟，而ｚａｐｒｉｎａｓｔ和ＦＳＨ联合使用时，则　

ｚａｐｒｉｎａｓｔ能显著抑制ＦＳＨ对卵母细胞成熟的促进效　

加　∞　∞　∞　柏　加　０　

羹害　

镁盎　

羹暑　

镁苗　

曩　

兽　

童　

０　１０（ｕｍｏｌ／Ｌ）

主　

０　１０（ｕｍｏｌ／Ｌ）　

Ａ：ｚａｐｒｌｎａｓｔ对ＣＯＧｓ自发成熟的影响；Ｂ：ｚ￣ｐｒｉｈａｓｔ对ＤＯｓ自发成熟的影响．＊Ｐ＜０，０１，与０　ｕｍｏｌ／Ｌ组相比。　

图１　ｚａｐｒｉｎａｓｔ对小鼠卵母细胞自发成熟的影响　

Ａ：Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｚａ　ｈａｓｔ　ｏｎ　ＣＯＣｓ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ；Ｂ：Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｚａｐｆｉｎａｓｔ　ｏｎ　ＤＯｓ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．　

Ｂ加　∞　∞　∞　柏　加　０　

ｉｒｉｇ．１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｚａｐｆｉｎａｓｔ　ｏｎ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｍｅｉｏｔｉｃ　ｍａｔｕｒａｔｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｏｏｃｙｔｅｓ．＊Ｐ＜Ｏ．Ｏ１．ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　０　Ｆｍｏｌ／Ｌ　ｇｒｏｕｐ　

卵母细胞内的动态变化对哺乳动物卵母细胞减数分　

裂的恢复和阻滞起重要的调节作用。参与细胞内调　

节ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ水平的酶类包括腺苷酸环化酶　

（ＡＣ）、鸟苷酸环化酶（ＧＣ）和ＰＤＥ。这几种酶的平　

衡使细胞内ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ水平维持在正常范围内。　

最初的研究使用非选择性或第一代ＰＤＥ抑制剂，如　

ＩＢＭＸ、罂粟碱、茶碱、己酮以及可可豆碱来研究ＰＤＥ　

的活性。这些抑制剂只是广泛抑制好多种ＰＤＥ，而　

ＦＳＨ（５ｏｒｔＪ￣Ｌ）

ｚａｐｒｉｎａｓｔ（ｕＭ）

０　

０　

５０　

０　

５０　

ｌｏｏ　

不直接抑制任何一种ＰＤＥｓ，缺乏特异性抑制腺苷的　

作用。第二代或ＰＤＥ特异性抑制剂的问世，允许评　

价特异ＰＤＥ在完整细胞环核苷酸降解通路中的生　

理作用“　。使用特异性ＰＤＥ抑制剂，几位学者已先　

’Ｐ＜０．０５，”Ｐ＜０．０１，与对照组相比；　Ｐ＜０，０１，与ＦＳＨ组相　

比　

图２　ｚａｐｒｉｎａｓｔ对ＦＳＨ诱导的ＨＸ阻滞的小鼠卵母细胞成　

熟的影响。　

’Ｐ＜Ｏ．０５．’’Ｐ＜０．０１．ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；　

０．０１，ｃｃ　

．

后证明ＰＤＥ３选择性抑制剂能显著抑制小鼠、牛以　

及狒狒卵母细胞的自发成熟　

ＰＤＥ５为ＰＤＥ同工酶的一种，其能够选择性地　

’Ｐ＜　

ｗｉｔｈ　ＦＳＨ　ｇｒｏｕｐ．　

水解ｃＧＭＰ，广泛分布于机体的多种组织器官中¨　。　

ＰＤＥ５抑制剂最初报道用于治疗高血压、心绞痛等心　

血管疾病¨　。近年来，ＰＤＥ５选择性抑制剂在临床　

上用于治疗勃起功能障碍的成功更使人们对ＰＤＥ５　

在生殖系统中的研究产生了浓厚的兴趣“引。在我　

２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｚａｐｆｉｎａｓｔ　ｏｎ　ＦＳＨ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｍｏｕｓｅ　ｏｏｃｙｔｅ　

ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　

３讨论　

本研究通过不同的体外培养模型，证明了ＰＤＥ５　

选择性抑制剂ｚａｐｒｉｎａｓｔ对小鼠卵母细胞的自发成　

熟，ＨＸ阻滞的ＦＳＨ诱导成熟以及卵泡卵母细胞成　

熟均有明显的抑制效应。提示，ＰＤＥ５能促进小鼠卵　

们的实验中，ＰＤＥ５选择性抑制剂ｚａｐｒｉｎａｓｔ既能显著　

抑制小鼠卵母细胞的自发成熟，又能显著抑制ＦＳＨ　

诱导的ＨＸ阻滞的卵母细胞成熟以及卵泡卵母细胞　

的成熟，此抑制效应类似于ＰＤＥ３选择性抑制剂的　

母细胞的体外成熟。　

ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ是重要的细胞内第二信使，其在　

效应。提示，ＰＤＥ５在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过　

程中具有重要的调节作用。我们以前的研究工作表　

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