2024年4月20日发(作者：)

第３ｏ卷第６期　

长春师范学院学报（自然科学版）　

２０１１年１２月　

Ｖ０１．３０　Ｎｏ．６　

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　

Ｄｅｃ．２Ｏｌ１　

猪肠道来源乳杆菌的益生特性研究　

刘春红　，戴春燕２　

（１．长春大学特殊教育学院，吉林长春１３００２２；２．长春市第９８中学，吉林长春１３００４１）　

［摘要］通过体外耐酸、耐胆盐和抗氧化活性分析法研究了猪肠道来源的５株乳杆菌的潜在益生特　

性。结果表明，５株乳酸杆菌均能耐受ｐＨ３．０。菌株ＰＣＬ　３对ｐＨ　２．０具有良好耐受能力。受试菌株对　

０．３％　１．０％的牛胆盐具有良好的耐受能力，１％（ｗ／ｖ）胆盐处理４ｈ，所有受试菌株的存活率均高于　

８０％。抗氧化活性分析表明，菌株具有一定的体外清除羟自由基和ＤＰＰＨ自由基能力　，　

［关键词］乳杆菌；益生性；耐受；抗氧化　

［中图分类号】ＴＳ２０１．３　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００８一ｌ７８ｘ（２０ｌ１）０６—００６２—０３　

益生菌是指通过摄入充足的量，对宿主健康起有益作用的活的微生态制剂。乳杆菌是益生菌最主要的来　

源菌种之一。大量的研究表明，益生性乳杆菌具有激活机体的免疫系统，缓解肠道炎症，降低胆固醇等多方　

面的生理功能［　。由于乳杆菌公认的食用安全性和健康促进作用，其在发酵和非发酵食品工业中具有广阔的　

应用前景。能耐受消化道的低ｐＨ值和高胆盐环境，并能在宿主体内定植是乳杆菌发挥益生作用的基础，也　

是筛选益生菌的重要指标。本研究从猪肠道分离鉴定了５株乳杆菌，通过体外筛选方法对这些菌株的耐酸、　

耐胆盐和抗氧化活性进行了分析，评价了菌株的潜在益生特性。　

１材料与方法　

１．１实验材料、主要仪器和试剂　

猪肠收集自长春市某生猪屠宰场。取新宰杀的生长期约１０个月的商品猪的肠道。　

紫外可见分光光度计Ｃａｒｌ　３００（美国ＶＡＲＩＡＮ公司）；高压蒸汽灭菌器（日本Ｓａｎｙｏ公司）；蛋白胨、酵　

母浸膏（北京奥博星生物技术有限公司）；１，１一二苯基一２一三硝基苯肼（ＤＰＰＨ）（美国Ｓｉ￣ｎａ公司）。　

１．２实验方法　

１．２．１菌株的分离和筛选　

猪肠壁黏膜液稀释后，依次经ＢＣＰ和ＭＲＳ琼脂平板反复划线培养，分离纯培养菌种。纯培养菌种经革　

兰氏染色及过氧化氢酶试验、吲哚反应和产硫化氢试验等生化鉴定方法筛选乳杆菌。　

１．２．２　ｐＨ耐受实验　

１６ｈ培养的菌液用灭菌生理盐水稀释成ｌ０８　ｃｆｕ・ｍＬ　的菌悬液。菌种按３％的接种量加到ｐＨ２．０、３．０、　

６．６的液体ＭＲＳ中（用盐酸调至所需ｐＨ），于３７￣Ｃ下分别培养ｌｈ和３ｈ，稀释涂布于ＭＲＳ琼脂平板，３７％培　

养４８ｈ后菌落计数。以活菌数对数值与原始菌数对数值的比值的百分数计算存活率（％）。　

１．２．３耐胆盐实验Ｌ３　

ｌ０８　ｃ　・Ｈ１ＩＪ＿１的菌悬液。按３％的接种量加到含有０、０．３％、０．５％和１．０％（ｗ／ｖ）牛胆盐的ＭＲＳ液体培　

养基中。于３７℃培养４ｈ，取出稀释、涂布于ＭＲＳ琼脂平板。３７ｑＣ培养４８ｈ后菌落计数。按耐酸实验方法计　

算存活率（％）。　

１．２．４清除羟自由基　

采用Ｆｅｎｔｏｎ法检测菌株对羟自由基的清除作用Ｈ］。向含有ｌｍＬ亮绿（０．４３５ｍｍｏｌ・Ｌ　），２ｍＬ硫酸亚铁　

（Ｏ．５ｒｅｏｔｏｌ・Ｌ　），１．５ｍＬ过氧化氢（３％）的Ｆｅｎｔｏｎ反应体系中分别加入ｌｍＬ１０ｎｃｆｕ・ｍＬ－１的乳杆菌菌液，混合　

均匀后，３７％恒温水浴２０ｒａｉｎ，波长６２４ｎｍ处测定吸光度。按以公式（１）计算清除率：清除率＝［（　一　

Ａ０）／（Ａ—Ａｏ）］×１００％。式中：Ａ为不含Ｆｅｎｔｏｎ试剂和菌液样品、含有亮绿的吸光度；Ａ０为含Ｆｅｎｔｏｎ试　

［收稿日期］２０１１—０９—２７　

［作者简介］刘春红（１９７６一），女，吉林通化人，长春大学特殊教育学院讲师，硕士，从事生物活性物质的分离筛选研究。　

・

６２・　

剂和亮绿，不含菌液样品的吸光度；Ａ　为含有Ｆｅｎｔｏｎ试剂、样品和亮绿的吸光度。　

１．２．５清除ＤＰＰＨ自由基　

ｌｒｒｄ浓度为ｌＯ¨ｃｆｕ・ｍＬ一的乳杆菌菌液，加入２ｍＬＤＰＰＨ甲醇溶液（０．５ｍＭ），混合均匀后室温下避光反　

应３０ｒａｉｎ，离心（８０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｒａｉｎ，４（１ｃ），取上清液５１７ｎｍ处测定ＯＤ值，无菌水空白调零。空白组以等体　

积甲醇代替ＤＰＰＨ溶液，对照组以等体积无菌水代替乳杆菌。按下列公式计算清除率（％）：清除率（％）＝［１　

一

（Ａ样品一Ａ空白）／Ａ对照ｊ　ｘ　ｌ０Ｏｏ　

２结果与讨论　

２．１乳杆菌的分离和鉴定　

本研究从猪肠道中分离出的５株菌均为革兰氏阳性杆菌，在过氧化氢酶反应试验、硝酸盐还原试验、明　

胶液化试验、吲哚试验、联苯胺试验、Ｈ２Ｓ产生试验以及运动性试验中均呈阴性，因此鉴定为乳杆菌属的细　

菌。　

２．２酸耐受实验　’　

空腹时胃液的ｐＨ值在２．０左右，进食后通常维持在３．０。食物在胃中的消化时间相对较短，一般为ｌ　

４ｈ。能够在胃液低ｐＨ环境中存活是益生菌的重要特性之一。只有能够耐受胃酸的菌株才有可能以一定的活　

菌数量进入小肠。目前对菌株耐酸性试验通常采用模拟胃酸的体外实验方法来进行。本研究对５株猪肠道分　

离的乳杆菌的耐酸试验结果如表１所示，５株受试菌对不同ｐＨ的耐受能力存在一定的差异，尤其是耐受　

ｐＨ２．０，菌株ＰＣＬ３在ｐＨ２．０，３７℃条件下培养３ｈ后，活菌存活率为４７．５６％，而菌株ＰＣＬ５的存活率为０。各　

受试菌株对ｐＨ３．０均有较强的耐受能力，在ｐＨ３．０，３７℃条件下培养３ｈ后，活菌存活率均超过８０％。　

表１乳杆菌的低ｐＨ耐受能力　

存活率（％）　

菌株　ｐＨ２．０　ｐＨ３．０　

ｌｈ　３ｈ　ｌｈ　３ｈ　

Ｐ（　１　４９．１２　３４．１１　９２．３７　８１．１１　

ｐＣＬ　２　４３．４３　３８．２２　９３．６３　８２．５２　

ＰＣＬ　３　７５．８ｌ　４７．５６　９０．５５　８９．５３　

ＰＣＬ　４　６１．４５　２９．２５　９１．３８　８８．６５　

Ｐ（＝＝Ｌ　５　ｌ９．７６　０　９０．８２　８７．６ｌ　

２．３胆盐耐受实验　

微生物对胆盐的抗性作为潜在益生菌的一个选择指标。５株植物乳杆菌在不同浓度牛胆盐均有较强的耐　

受能力，其中菌株ＰＣＩ３对１％胆盐耐受能力最强，４ｈ的存活率为９０．１６％（表２）。菌株ＰＣＩＡ在胆盐浓度　

Ｏ．５％的条件下的存活率略高于在胆盐浓度为０．３％下的存活率。Ｂｕｍｓ等｝６Ｊ报道植物乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　

ｐｌａｎｔａｒｕｍ）０８３４２和２０１７４在０．５％胆盐浓度下的存活率也高于０．３％胆盐浓度，这说明适当的胆盐浓度　

（０．５％）可能刺激某些乳杆菌的生长。一些研究表明，乳杆菌对胆盐的耐受除与胆盐种类、浓度有关，也具　

有菌株特异性，受菌株来源和种类的影响。本研究的５株乳杆菌均具有较强的耐胆盐能力也证实了这一点。　

表２乳杆菌的胆盐耐受作用　

存活率（％）　

菌株　

Ｏ．３％　Ｏ．５％　１．Ｏ％　

ＰＣＬ１　９２．８２　８８．７１　８３．７３　

Ｐ（＝Ｌ２　９３．８６　８７．６７　８１．６２　

ＰＣＩ３　９５．Ｏ１　９１．３Ｏ　９０．１６　

ＰＣＬ４　９２．２３　９４．０３　８５．３４　

ＰＣＨ５　９３．４３　８６．９６　８０．８０　

２．４羟自由基清除作用　

羟自由基是机体新陈代谢过程中产生对生物体毒性强、危害大的一种自由基。Ｆｅｎｔｏｎ反应产生的羟自由　

基是Ｈ２０２与金属离子（如Ｆｅ　和Ｃｕ２　等）的作用。研究表明，乳酸菌并不能直接清除羟自由基，而是利用　

其多羟基结构螯合金属离子（如Ｆｅ２　和Ｃｕ２　等）抑制羟自由基的产生［　，因此金属螯合能力是乳杆菌清除　

羟自由基的可能机制之一。Ｌｅｅ等　］研究发现，干酪乳杆菌（Ｌ．ｃａｓｅｉ）ＫＣＴＣ　３２６０能通过金属螯合作用而抗　

・

６３　・　

氧化。本研究通过对Ｆｅｎｔｏｎ反应产生的羟自由基的清除作用研究菌株的抗氧化活性（表３）。不同菌株的羟　

自由基清除能力差异明显。在１　ｘ　１０“ｃｆｕ・ｍＬ　浓度下，乳杆菌ＰＣＬ３和ＰＣＬＩ具有较强的清除羟自由基的能　

力，清除率分别为５３．８６％和２５．３５％。　

表３乳杆菌对羟自由基和ＤＰＰＨ自由基的清除率　

ＰＣＬ　１　ＰＣＬ　２　ＰＣＬ　３　ｐＣＬ　４　

％　

ＰＣＬ　５　

羟自由基　

Ｄ　ＰＨ　

２５．３５　

３３．１５　

１４．７６　

３２．８４　

５３．８６　

３５　６３　

ｌ０．５７　

３３．５４　

ｌ】．３ｌ　

３４．６９　

２．５　ＤＰＰＨ自由基清除作用　

ＤＰＰＨ自由基分析方法是目前广泛使用的评价和筛选抗氧化剂的方法。ＤＰＰＨ是具有高度共轭结构的含　

氮化合物，是一种稳定的有机自由基，有单个电子，当有自由基清除剂存在时，与其单电子配对的颜色减　

退，从而可以检测自由基清除情况及物质的抗氧化能力。因此，可根据抗氧化性物质对ＤＰＰＨ的特定波长的　

吸收光谱的减弱程度来判断活性物质的抗氧化能力。本研究分析了５株乳杆菌ＤＰＰＨ自由基的清除作用，结　

果如表３所示。各菌株在１　ｘ　１０ｎ　ｃｆｕ・ｍＬＩ１浓度时，对ＤＰＰＨ自由基的清除作用在均在３０％以上，各菌株菌　

株的清除能力相近。一些研究表明，短乳杆菌（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）ＢＪ２０Ｅ　］和嗜酸乳杆菌（Ｌ。ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＡＴＣＣ　

４３５６［１０］表现出强烈的ＤＰＰＨ自由基清除作用。本实验的研究结果也进一步证明了乳杆菌的ＤＰＰＨ自由基清除　

能力。　

３结论　

本研究对５株新分离的乳杆菌的体外益生特性进行了初步研究，结果表明菌株ＰＣ　在低ｐＨ耐受、耐　

胆盐和抗氧化等方面均优于其他受试菌株。鉴于体内与体外实验结果可能存在一定的差异，仅仅用体外实验　

数据实验结果来说明乳杆菌的益生性还不够充分。因此，后续研究将开展动物体内实验，进一步验证该菌株　

的益生特性。　

［参考文献］　

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［８］　Ｊ，ＨｗａｎｇＫ，ＣｈｕｎｇＭ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆＬａｅｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ　ＫＣＴＣ　３２６０　ｔｏ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ（ＲＯＳ）：Ｒｏｌｅ　ｆｏｒ　ａ　ｍｅｔａｌ　ｉｏｎ　

ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ［Ｊ］．Ｊ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ，２００５，７０（８）：３８８—３９１．　

［９］【ｅｅ　ＢＪ，Ｋｉｍ　ＪＳ，ＫｍＳ　ＹＭ，ｅｔ　ａ１．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｙｔ　ｎｄ　ａ７一ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｅａｃｉｄ（ＧＡＢＡ）ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　ｓｅａ　ｔａｒＩ　ｅ　ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ　ｂｙ　Ｉ．ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｓｕ　

ｂｒｅｖｉｓ　ＢＪ２０　ｉｓｏｌａｔｄ　ｅｆｒｏｍ　ｔｒａｄｉｉｔｏｎａｌ　ｆｅｒｍｅｎｔｄ　ｅｆｏｏｄｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｃｂｅｍ，２０１０（１），１２２：２７１—２７６１　

［ＩＯ］ＬＬｎ　ＭＹ，Ｃｈａｎｇ　ＦＪ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｂｉｉｆｄｏｂａｃｔｅｆｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ＡＴＣＣ　１５７０８　ａｎｄ　Ｌａｃｔｏｂａｅｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｓ　ＡＴＣＣ　ｕ

４３５６［Ｊ］．Ｄｉｇｅｓｔ　Ｄｉｓ　Ｓｃｉ，２０００，４５（８）：１６１７—１６２２．　

Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ　Ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　Ｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｐｉｇ　

ＬＩＵ　Ｃｈｕｎ—ｈｏｎｇ　，ＤＡＩ　Ｃｈｕｎ—ｖａｎ２　

（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｓｐｅｃｉａｌ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｈａｎｇｃｈｔｍ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１３００２２，Ｃｈｉｎａ；　

２．Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　Ｎｏ．９８　Ｍｉｄｄｌｅ　Ｓｃｈｏｏｌ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１３００４１．・，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｉｖｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ　ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｐｉｇ　ｗｅｒｅ　ｅｖａ／ｕａｔｅｄ　ｆｏｒ　ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ　ｐｏ—　

ｔｅｎｔｉａｌ　ｗｉｈ　ｔｔｈｅ　ｐＨ　ａｎｄ　ｂｉｌｅ　ｓａｌｔｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ａｎｄ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ａｌｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｇｒｅｗ　ｗｅｌｌ　ａｔ　ａｃｉｄ　

ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（ｐＨ　３．０，３ｈ　ｏｆ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）．Ａｍｏｎｇ　５　ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ　ｓｔｒａｉｎｓ，ｐＣＩ３　ｓｈｏｗｅｄ　ｇｏｏｄ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｐＨ　２．０　ｆｏｒ　３ｈ．Ａ１ｌ　

ｓｔｒａｉｎｓ　ｃｏｕｌｄ　ｓｕｒｖｉｖｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ａｔ　０．３％一１％ｂｉｌｅ　ｓａｌｔｓ．ＰＣＬ３　ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ａｂｉｌｉ￣ｏｆ　ｂｉｌｅ　ｓｌｔａｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．　

Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ　ｔｅｓｔｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｌｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｄｉｓｐｌａｙｅｄ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ｓｃａｖｅｎｇｅ　ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ａｎｄ　ＤＰＰＨ　ｒａｄｉｃａｌｓ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ；ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ；ｔｏｌｅｒａｎｃｅ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ　

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６４・