2024年4月27日发(作者：)
基于线粒体COI序列的DNA条形码在中国海口足类物种鉴
定中的应用分析
沙忠利;王永良;程娇
【摘 要】中国海口足类动物区系具有丰富的物种多样性,是我国海洋底栖生物中的
重要经济类群.口足类的属内种间鉴别特征有的极为相似,仅依靠传统的形态分类方
法很难对近缘种和疑难种进行准确的鉴定.DNA条形码技术可以弥补传统形态学鉴
定的某些局限,为物种鉴定提供了有效的工具.该研究探讨了利用线粒体COI序列对
中国海口足类进行物种鉴定的可行性,共获得口足目4总科6科24属38个种的
204条线粒体COI序列,与GenBank收录的14种42条口足类同源序列进行比对,
结果显示口足类COI基因不存在碱基插入缺失现象,碱基组成偏倚明显,A+T含量
(63.5％)显著高于G+C含量(36.5％).基于Kimura双参数模型计算遗传距离,结果
显示遗传距离随着分类阶元的增高而增大.同物种种内个体间的遗传距离变化范围
在0％～3.91％,平均值为0.76％.同属内各物种间的遗传距离变化范围为6.55％～
18.99％,平均值为12.91％.同科内不同属间的遗传距离变化范围为9.16％～
23.32％,平均值为16.89％.不同科间的遗传距离变化范围为16.52％～26.6％,平均
值为21.31％.由此可见,口足类COI基因的种间和种内遗传距离存在明显的间隙.基
于COI序列构建的口足类邻接关系树显示所有包含大于1个个体的物种均可形成
单系群,且节点支持率均为100％.本研究证明了COI序列作为DNA条形码标准基
因在口足类物种鉴定中的有效性.此外,研究发现中国沿海分布的口虾蛄可能至少存
在两个隐存种,实证了基于COI序列的DNA条形码技术能够用于口虾蛄隐存多样
性的探究.
【期刊名称】《中国水产科学》
【年(卷),期】2018(025)004
【总页数】9页(P858-866)
【关键词】口足类;COI基因;DNA条形码;物种鉴定;隐存种
【作 者】沙忠利;王永良;程娇
【作者单位】中国科学院海洋研究所, 山东 青岛 266071;中国科学院大学, 北京
100049;中国科学院海洋大科学研究中心, 山东 青岛 266071;中国科学院海洋研究
所, 山东 青岛 266071;中国科学院海洋研究所, 山东 青岛 266071;中国科学院大学,
北京 100049
【正文语种】中 文
【中图分类】S917
口足类(Stomatopoda)是一类形态结构很特殊的高等甲壳动物, 属于软甲纲
(Malacostraca)内三个亚纲中形态构造最为独特的掠虾亚纲(Hoplocarida), 其体
躯分节格局和附肢结构以及生态习性与软甲纲其他类群有显著差异, 在海洋甲壳动
物的系统进化上占有重要地位[1]。掠虾亚纲中仅有口足目1目, 现生种超450种,
分隶于7总科17科[2]。中国海口足类动物区系具有丰富的物种多样性, 目前已记
录有6总科12科42属104种[3], 约占世界已知种数的1/4。由于20世纪90年
代我国近海的主要经济鱼类资源持续衰退, 桁杆拖网作业得到逐步发展, 部分口足
类物种作为资源量大、经济价值较高的渔业资源逐渐被利用, 特别是口虾蛄
Oratosquilla oratoria (De Haan, 1844)在渤海、黄海、东海近岸海域拖网的渔获
物中占主要优势[4-5]。口足类可根据其掠肢形态分为2类: 一类是掠肢指节具数个
尖的矛刺而成为高效捕食者的“矛刺型”(spearers), 主要栖息于浅海泥沙底质; 而
另外一类是掠肢基部形成击锤状的“锤击型”(smashers)[6], 锤式掠肢适于捕食珊
瑚礁等硬底质环境中常见的蟹类和软体动物。口足类成体和幼体间的形态差异较大,
而同一属内各物种成体间的鉴别特征有的极为相似, 这使得口足类物种鉴定十分困
难, 因此仅依靠传统的形态分类方法很难对口足类近缘种和疑难种进行准确的鉴定
[1]。DNA分类方法的发展, 能够从不同角度填补传统分类的不足或解决一些传统
分类无法入手的难题。大量的研究表明线粒体细胞色素c氧化酶(COI)5′端区域可
作为动物物种识别的标准基因并得到广泛应用[7]。目前, 常用的DNA条形码
(DNA barcoding)分析方法有两种: 距离法(distance- based method)和单系法
(monophyly-based method)[7]。距离法主要是根据物种种间和种内的遗传差异,
检测是否存在条形码间隙(barcoding gap); 单系法则是通过构建进化树来判断各
物种之间是否互为单系群(monophyletic group)[8]。尽管DNA条形码技术在实
际应用方面存在争议, 然而因为其便捷可行, 且与传统形态分类方法结合能够提高
物种鉴定的速度和准确性, 加快新物种和隐存种的发现[9-11], 受到国际学术界的广
泛重视。
DNA条形码已经在海洋甲壳动物分类和隐存多样性研究中得到成功应用[12-15],
但是国内尚未有将线粒体COI基因应用于口足类条形码研究的相关报道。本研究
分析了中国沿海4总科6科24属38种口足类204个个体的线粒体CO I序列, 与
GenBank收录的14种42条口足类同源序列进行比对, 拟解决以下问题: (1) 所研
究的口足类COI序列之间是否存在条形码间隙; (2) 口足类不同种类之间是否在系
统树上互为单系群; (3) 基于线粒体COI序列的DNA条形码对口足类进行物种鉴
定和隐存种发掘是否具有可行性。
用于本研究的204个口足类样品均为中国科学院海洋生物标本馆馆藏标本, 所有样
品经王永良研究员形态学鉴定后, 共包括口足目4总科6科24属38种(表1), 其
中长叉三宅虾蛄Miyakea nepa (Latreille in Latreille, Le Peletier, Serville &
Guérin, 1828)、断脊小口虾蛄Oratosquillina interrupta (Kemp, 1911)、口虾
蛄样品含不同的地理群体。按照酚/氯仿提取法从肌肉组织中提取基因组DNA。
线粒体COI基因的PCR扩增引物为无脊椎动物DNA条形码通用引物LCO1490
(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198 (5′-
TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)[16]。PCR采用25 μL反应体系, 含
10 mmol/L Tris, pH 8.3, 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl2, dNTP 200
µmol/L, 上下游引物各200 nmol/L, Taq DNA 聚合酶(TaKaRa) 1.25 U, DNA模
版10~100 ng, 最后加灭菌蒸馏水至25 μL。PCR反应条件参照引物出处的参考
文献[16]。每组PCR反应均设阴性对照以检测是否存在DNA污染。
取PCR扩增产物2 μL用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测后, 选取扩增良好的样
品进行纯化回收。产物回收时用2%的琼脂糖凝胶, 150 V电压电泳, 用Axygen
DNA凝胶回收试剂盒进行回收和纯化, 回收的具体步骤参照试剂盒说明书。将回
收纯化后的PCR产物送至英潍捷基(上海)有限公司用ABIPRISMTM3730XL DNA
Analyzer测序仪进行正反向测序。
测序原始序列由DNASTAR (DNASTAR, Madison, WI, USA)软件包进行编辑、比
对和排序, 最后辅以人工校对。从GenBank中下载了口足类线粒体COI序列14
种42条(具体信息如表1所示), 经MEGA v6.06[17]软件中内置的Muscle多序列
比对程序比对后截取同源序列。利用ARLEQUIN v3.5[18]软件计算分子多样性参
数如多态位点个数、转换颠换比例和插入缺失位点数等。利用Kimura双参数模型
(Kimura-2-parameter, K2P)[19]计算序列间的遗传距离。基于K2P模型, 以叶虾
类(Dahlella caldariensis DCU92670)作为外群, 采用邻接法(neighbour-joining,
NJ)构建系统发育树, 进行1000次自展分支检验。遗传距离的计算和系统发育树的
构建均在MEGA v6.06[17]软件中完成。
研究所用引物位于COI基因5′端, 成功扩增出口足类38种204条COI序列, 长度
均为658 bp。将实验获得的COI序列与GenBank下载序列进行多序列比对, 最
终获得246条COI同源序列, 长度为550 bp。通过序列比对检测到多态位点223
个, 其中包含简约信息位点217个, 同时发现核苷酸替换417处, 其中颠换122处,
转换295处, 不存在插入/缺失。
口足类COI序列的平均碱基组成分别为T 35.1%、C 18.2%、A 28.4%、G 18.4%,
碱基组成偏倚明显, A+T含量(63.5%)显著高于G+C含量(36.5%)。密码子三个位
置的碱基组成也呈反GC偏倚, 其中第1位密码子GC碱基平均含量最高, 达
47.3%; 第2位密码子次之, 平均含量为42.6%; 第3位密码子最小, 平均含量仅为
19.6%(表2)。
DNA条形码间隙的存在依赖于种内遗传差异要远小于种间差异。本研究发现种内
最大遗传距离发生在口虾蛄内, 高达3.91%, 远高于种内平均遗传距离(0.76%), 分
析可能存在隐存种(详见第3.1节)。图1和表3显示了基于Kimura双参数模型计
算的口足目不同分类水平的COI序列距离, 结果显示遗传距离随着分类阶元的增高
而增大。同物种种内个体间的遗传距离变化范围在0%~3.91%, 平均值为0.76%。
同属内各物种间的遗传距离变化范围在6.55%~18.99%, 平均值为12.91%。同科
内不同属间的遗传距离变化范围在9.16%~23.32%, 平均值为16.89%。不同科间
的遗传距离变化范围在16.52%~26.6%, 平均值为21.31%。由此可见, 口足类
COI基因的种间和种内遗传距离存在明显的间隙。
基于线粒体COI序列构建的口足类邻接关系树(图2)显示所有包含大于1个个体的
物种均可形成单系群, 且节点支持率均为100%。口虾蛄所有个体聚为一支, 但存在
两个高度分化的支系, 并且具有很高的支持度(99%), 推测口虾蛄至少包含两个隐存
的分类单元。此外, 在邻接关系树上还发现一些与传统形态分类不一致的现象, 如
虾蛄科口虾蛄属的黑斑口虾蛄Oratosquilla kempi (Schmitt, 1931)并未与同属的
口虾蛄聚为一支, 而与长叉三宅虾蛄聚在一起; 屈足东方虾蛄Quollastria
gonypetes (Kemp, 1911)没有聚在东方虾蛄属的分支内, 而与脊条褶虾蛄
Lophosquilla costata (de Haan, 1844)聚在一起; 在科级水平, 齿指虾蛄科的代表
物种脊尾齿指虾蛄Odontodactylus cultrifer (White, 1850)与指虾蛄科种类发生
聚类。
由于门类繁多及生态习性的特殊性, 很多海洋生物类群中都存在一些形态上极其相
似但在生殖上已发生隔离的隐存种。随着DNA分类方法的发展和应用, 物种隐存
多样性越来越多地被发现, 这也提示科研人员需要对目前的海洋生物多样性状况进
行重新审视。在许多海洋甲壳动物中发现了隐存种, 这一现象在口足类中也有报道
[20-21]。Barber等[20]对印度-太平洋海域的指虾蛄总科67个种的COI序列进
行了分析, 发现所研究的327个个体中, 物种鉴定准确率高达96.5%, 并发现5个
种类存在隐存种。同时, Barber等[21]利用线粒体COI基因分子标记, 发现分布在
珊瑚礁三角区的3种同域分布且生态习性相似的口足类在系统发生树上均显示为3
个分支。尽管各分支在地理分布上存在部分重叠, 但有限的基因交流暗示各分支之
间应已发生生殖隔离, 进而推断这3种口足类应至少各包含3个隐存种。同时结合
其他证据, 笔者认为珊瑚礁三角区的物种多样性很可能被 低估。
口虾蛄是我国重要的海洋经济动物之一, 在沿海广泛分布, 由于营穴居生活且不作
长距离迁移[22], 通常表现出较高的遗传分化水平, 因而可能包含隐存的分类单元。
本研究发现不同地理群体的口虾蛄聚为两个高度分化的支系, 并且两支系内个体的
分布范围存在明显的地理差异: 支系A为南方组群, 包括东海和南海群体; 支系B为
北方组群, 包括渤海和黄海群体, 南北组群的地理分布以长江口为界。进一步研究
发现, 两个支系间的COI序列遗传距离(5.6%)要比支系内的平均遗传距离(0.43%
和0.72%)大很多, 这与在口足类其他种类中发现的隐存种间的遗传差异水平相似
(如Haptosquilla pulchella: 2.9%~6.6%; Haptosquilla glyptocercus:
4.7%~11.7%; Gonodactylellus viridis: 3.0%~10.6%)[21]。鉴于此, 基于COI序
列的DNA条形码技术能够用于口虾蛄隐存多样性的探究, 且研究表明中国沿海分
布的口虾蛄可能至少存在两个隐存种, 但仍需扩大采样范围, 并结合核基因及形态
信息进一步验证。
DNA条形码技术作为一种快速有效的物种鉴定工具在海洋生物分类中得到了广泛
的应用。距离法和单系法是常用的DNA条形码分析方法, 相关研究也已证实了其
在物种鉴定、挖掘物种隐存多样性和发现新物种等方面的有效性[10, 23-24]。本
研究利用这两种方法对基于线粒体COI序列的DNA条形码在口足类物种鉴定中
是否具有可行性进行了探究。Hebert等[10]提出利用COI基因序列鉴别物种的
10倍法则, 即种内与种间的标准差异阈值应该为种内平均遗传距离的10倍。在本
研究中, 种内个体间的COI序列遗传差异最大值为3.91%, 而平均值仅为0.76%;
属内不同种间COI序列差异最小值为6.55%, 平均值为12.91%。由此可见, 口足
类种内与种间遗传距离存在条形码间隙, 种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的
17倍, 证明DNA条形码距离分析法可以用于口足类的物种鉴定。
随着采样规模的扩大, 一些生物类群的种内遗传差异会显著提高, 而种间遗传差异
也会因分化时间较短的姐妹种的存在而降低, 导致物种种内与种间遗传差异出现重
叠区域[24-25]。此外, 不同物种的线粒体DNA碱基替换率差异很大, 也会导致种
内和种间序列距离的重叠, 进而影响种内和种间差异阈值的界定[26-27]。在这种情
况下, 基于系统发生的单系分析法被认为是替代距离分析法进行物种鉴定的一种有
效的条形码分析方法。本研究中, 在由246条口足类COI序列构建的邻接关系树
上, 所有包含大于1个个体的物种皆为单系, 不同种类能够被明显区分。鉴于此, 基
于系统发生的单系分析法能够对口足类物种进行有效鉴定。
口足类的属内种间鉴别特征有的十分相似, 仅一些细微的外部形态特征被用于近缘
种的分类学研究。例如, 小口虾蛄属中的前刺小口虾蛄Oratosquillina perpensa
(Kemp, 1911)和无刺小口虾蛄Oratosquillina inornata (Tate, 1883)间的外部形
态极为相似, 仅可通过额角长宽比例或局部刺的有无来区分。因此, 通过传统形态
分类学的方法对这些近缘种进行鉴定十分困难, DNA条形码技术的出现为口足类
疑难种及易混淆种类的界定提供了可能。本研究发现无刺小口虾蛄与前刺小口虾蛄
COI遗传距离较大, 高达12.6%, 种内遗传距离仅为0.91%和0.15%; 从系统树的
分布来看, 小口虾蛄属的种类聚在同一分支中, 无刺小口虾蛄先与断脊小口虾蛄聚
类, 再与北方小口虾蛄[Oratosquillina nordica (Ahyong & Chan, 2008)]、前刺
小口虾蛄聚为一支。鉴于上述分析, 无刺小口虾蛄与前刺小口虾蛄尽管外部形态差
异细微, 但属于同属两个不同种。由此可见, 在形态学研究的基础上, DNA条形码
应用于口足类分类学研究将大大提高物种鉴定的准确性和速度, 实证了COI基因作
为DNA条形码标准基因在口足类物种鉴定中的有效性。
本研究中出现了基于DNA条形码的分子分类结果与形态学的分类单元划分不一致
的现象, 推测可能是由单分子标记系统发育信息不足或形态特征不可靠等原因引起,
需要加大采样密度, 结合核基因分析和形态学分析对口足类的分类系统进行重新修
订。尽管如此, 距离法和单系法两种DNA条形码分析方法相互印证, 证实了将COI
基因作为DNA条形码标准基因在口足类物种鉴定和隐存种挖掘方面是可行的。
【相关文献】
[1] Cheng J, Wang Y L, Sha Z L. Progress on the systematics of Stomatopoda
(Crustacea: Malacostraca)[J]. Marine Sciences, 2015, 39(12): 173-177. [程娇, 王永良, 沙忠利.
口足目系统分类学研究进展[J]. 海洋科学, 2015, 39(12): 173-177.]
[2] Ahyong S T. Revision of the Australian Stomatopod Crustacea[M]. Records of the
Australian Museum, 2001: 1-326.
[3] Liu R Y. Checklist of Marine Biota of China Seas[M]. Beijing: Science Press, 2008. [刘
瑞玉. 中国海洋生物名录[M]. 北京: 科学出版社, 2008.]
[4] Gu D X, Liu M L. Analysis on the population structure and abundance of
Oratosquilla oratoria in Tianjin sea area[J]. Hebei Fisheries, 2011(8): 24-26. [谷德贤, 刘茂利.
天津海域口虾蛄群体结构及资源量分析[J]. 河北渔业, 2011(8): 24-26.]
[5] Yu C G, Chen Q Z, Chen X Q, et al. Species composition and quantity profile of
mantis shrimp around Zhoushan fishing ground[J]. Journal of Dalian Ocean University,
2011, 26(2): 153-156. [俞存根, 陈全震, 陈小庆, 等. 舟山渔场及邻近海域虾蛄类的种类组成和数量
分布[J]. 大连海洋大学学报, 2011, 26(2): 153-156.]
[6] Caldwell R L, Dingle H. Stomatopods[J]. Scientific American, 1976, 234(1): 80-89.
[7] Hebert P D N, Cywinska A, Ball S L, et a1. Biological identifications through DNA
barcodes[J]. Proceedings: Biological Sciences, 2003, 270(1512): 313-321.
[8] Toffoli D, Hrbek T, Araújo M L G, et al. A test of the utility of DNA barcoding in the
radiation of the freshwater stingray genus Potamotrygon (Potamotrygonidae,
Myliobatiformes) [J]. Genetics and Molecular Biology, 2008, 31(1): 324-336.
[9] Ni L H, Li Q, Kong L F. DNA barcoding and phylogeny in the family Mactridae
(Bivalvia: Heterodonta): evidence for cryptic species[J]. Biochemical Systematics and
Ecology, 2012, 44: 164-172.
[10] Hebert P D N, Ratnasingham S, de Waard J R. Barcoding animal life: cytochrome c
oxidase subunit I divergences among closely related species[J]. Proceedings: Biological
Sciences, 2003, 270: S96-S99.
[11] Xiao J H, Xiao H, Huang D W. DNA barcoding: new approach of biological
taxonomy[J]. Acta Zoologica Sinica, 2004, 50(5): 852-855. [肖金花, 肖晖, 黄大卫. 生物分类学
的新动向DNA条形码[J]. 动物学报, 2004, 50(5): 852-855.]
[12] Yuan S, An J M, Sha Z L. DNA taxonomy of Balanidae[J]. Marine Sciences, 2012,
36(9): 82-88. [原帅, 安建梅, 沙忠利. 藤壶科DNA分类研究[J]. 海洋科学, 2012, 36(9): 82-88.]
[13] Costa F O, deWaard J R, Boutillier J, et al. Biological identifications through DNA
barcodes: the case of the Crustacea[J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences,
2007, 64(2): 272-295.
[14] Radulovici A E, Sainte-Marie B, Dufresne F. DNA barcoding of marine crustaceans
from the Estuary and Gulf of St Lawrence: a regional-scale approach[J]. Molecular Ecology
Resources, 2009, 9(s1): 181-187.
[15] Wu T H, Tsang L M, Chan B K K, et al. Cryptic diversity and phylogeography of the
island associated barnacle Chthamalus moro in Asia[J]. Marine Ecology, 2015, 36(3): 368-
378.
[16] Folmer O, Black M, Hoeh W, et al. DNA primers for amplifcation of mitochondrial
cytochrome c oxidase subunit I form diverse metazoan invertebrates[J]. Molecular Marine
Biology and Biotechnology, 1994, 3(5): 294-299.
[17] Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA6: molecular evolutionary genetics
analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 2013, 30(12): 2725-2729.
[18] Excofer L, Lischer H E L. Arlequin suite ver 3.5: a new series of programs to perform
population genetics analyses under Linux and Windows[J]. Molecular Ecology Resources,
2010, 10(3): 564-567.
[19] Kumar S, Tamura K, Nei M. MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary
genetics analysis and sequence alignment[J]. Briefings in Bioinformatics, 2004, 5(2): 150-
163.
[20] Barber P, Boyce S L. Estimating diversity of Indo-Pacific coral reef stomatopods
through DNA barcoding of stomatopod larvae[J]. Proceedings: Biological Sciences, 2006,
273(1597): 2053-2061.
[21] Barber P H, Erdmann M V, Palumbi S R. Comparative phylogeography of three
codistributed stomatopods: origins and timing of regional lineage diversification in the
Coral Triangle[J]. Evolution, 2006, 60(9): 1825-1839.
[22] Wu Y Q, Zhang B L. Ecology of the economic invertebrates in the Bohai sea[J].
Marine Sciences, 1990(2): 48-52. [吴耀泉, 张宝琳. 渤海经济无脊椎动物生态特点的研究[J]. 海洋
科学, 1990(2): 48-52.]
[23] Hebert P D N, Stoeckle M Y, Zemlak T S, et al. Identification of birds through DNA
barcodes[J]. PLoS Biology, 2004, 2(10): e312.
[24] Chen J, Li Q, Kong L F, et al. CO I-based DNA barcoding in Tapetinae species
(Mollusca, Bivalvia, Veneridae) along the coast of China[J]. Zoological Research, 2010,
31(4): 345-352. [陈军, 李琪, 孔令锋, 等. 基于CO I序列的DNA 条形码在中国沿海缀锦蛤亚科贝
类中的应用分析[J]. 动物学研究, 2010, 31(4): 345-352.]
[25] Meyer C P, Paulay G. DNA barcoding: error rates based on comprehensive
sampling[J]. PLoS Biology, 2005, 3(12): e422.
[26] Will K W, Rubinoff D. Myth of the molecule: DNA barcodes for species can not
replace morphology for identification and classification[J]. Cladistics, 2004, 20: 47-55.
[27] Rubinoff D, Cameron S, Will K. A genomic perspective on the shortcomings of
mitochondrial DNA for “barcoding” identification[J]. Journal of Heredity, 2006, 97(6):
581-594.
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