2024年3月10日发(作者：)
中国水产科学 2018年11月, 25(6): 11721182
Journal of Fishery Sciences of China
DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.17439
研究论文
刺激隐核虫α-微管蛋白基因的克隆、原核表达及在生活史不同阶
段的mRNA表达
孙嘉阳
1
, 张子平
2
, 朱友芳
3
, 邹志华
1
, 韩坤煌
1
, 葛辉
4
, 王艺磊
1
1. 集美大学水产学院, 福建 厦门 361021;
2. 福建农林大学动物科学学院, 福建 福州 350002;
3. 莆田市水产科学研究所, 福建 莆田 351100;
4. 福建省水产研究所, 福建 厦门 361013
摘要: 从本实验室已有刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)转录组数据中筛选获得α-微管蛋白基因片段, 利用
5RACE和3RACE技术首次克隆获得其cDNA, 全长为1602 bp, 包含1356 bp的开放阅读框, 编码451个氨基酸,
预测蛋白质分子量为49.78 kD。生物信息学分析表明α-微管蛋白为亲水性非跨膜蛋白, 氨基酸序列的第142~148
位有特异且保守的GTP核苷酸结合位点(GGGTGSG)。对刺激隐核虫α-微管蛋白氨基酸序列进行同源性比对及进
化树分析, 发现其与间日疟原虫(Trypanosoma vivax)、丹氏锥虫(Trypanosoma danilewskyi)、八肋游仆虫(Euplotes
octocarinatus)、尾刺耐格里原虫(Naegleria gruberi)、眼虫(Euglena gracilis)等的序列一致性高达94%~95%,
且在系
统进化树上聚为一支。采用实时荧光定量PCR技术对α-微管蛋白基因在刺激隐核虫3个生活史阶段的表达进行检
测, 结果显示α-微管蛋白基因的表达量在纤毛虫时期显著高于包囊和滋养体时期(P<0.05)。我们进一步构建了α-
微管蛋白重组表达载体, 并转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中进行原核表达, SDS-PAGE分析
表明, 诱导表达的重组蛋白分子量约为50 kD, 与预测的结果一致, 即成功诱导表达α-微管蛋白。本实验结果为后
续制备α-微管蛋白有效亚单位疫苗防治刺激隐核虫病奠定了基础。
关键词: 刺激隐核虫; α-微管蛋白; 原核表达; 生活史; 实时荧光定量PCR
中图分类号: S917 文献标志码: A 文章编号: 10058737(2018)06117211
刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)又称海水
白点虫, 隶属前口纲、前管目、隐核虫科、隐核
虫属(Cryptocaryon)
[1]
, 广泛分布于热带和亚热带
海洋中, 除黄斑蓝子鱼(Siganus oramin)之外
[2]
,
几乎所有的海水硬骨鱼都可以成为其宿主
[3-4]
,
是海水中最具破坏性的寄生原虫之一
[5-6]
。其生命
周期是由宿主生活阶段和自由生活阶段两部分组
成, 并不需要中间宿主, 生活史主要分为3个阶
段, 即: 寄生在鱼体表面的滋养体阶段, 发育成
熟后成为包囊前体, 成熟的包囊前体离开宿主形
成附着在池壁底部的包囊阶段, 进而由包囊孵化
成感染期的纤毛幼虫阶段
[7]
。繁殖温度为10~30℃,
最适水温为25~30℃, 整个生命周期约1到2周时
间
[8]
。刺激隐核虫病感染的主要特征是鱼体表面
会出现大量白点, 故俗称“白点病”
[5]
。
由于刺激隐核虫的适宜生存水温范围广泛,
无中间宿主, 繁殖周期短, 繁殖率高, 且在高密
度集约化的养殖模式下, 一旦鱼体感染, 便会引
发大面积死亡造成巨大的经济损失
[8-10]
。目前对
刺激隐核虫的防治方法主要分为化学防治, 物理
防治, 免疫防治三大类。化学防治包括浸泡高锰
酸钾、福尔马林、氯酸钠、硫酸铜以及中草药治
收稿日期: 2017-12-11; 修订日期: 2018-01-18.
基金项目: 福建省海洋与渔业厅五新项目(2); 福建省科技厅高校产学合作项目(2017N5002).
作者简介: 孙嘉阳(1992–), 女, 硕士研究生, 从事分子生物学研究. E-mail: 344156662@
通信作者: 王艺磊, 教授, 从事分子生物学研究. E-mail: ylwang@
第6期 孙嘉阳等: 刺激隐核虫α-微管蛋白基因的克隆、原核表达及在生活史不同阶段的mRNA表达 1173
疗
[5, 11-15]
。物理防治主要是通过移除包囊、淡水
浸泡以及用紫外线或臭氧对养殖水体进行杀菌来
实现
[12, 16-18]
。然而，前两种方法有诸多缺点, 化
学防治容易对养殖环境造成破坏, 难以在大面积
开放水体中使用, 且对鱼体有毒副作用或有药物
残留。物理防治则易对病鱼造成较强的应激反应。
近年来的研究发现用天然的刺激隐核虫体做抗原
能诱发宿主鱼产生先天性和获得性的免疫反应
[19]
,
这给刺激隐核虫感染的免疫诊断方法和免疫预防
措施的开发提供了理论依据。越来越多的证据表
明制备刺激隐核虫疫苗来免疫寄主鱼能够有效保
护寄主鱼免受刺激隐核虫侵染
[20-21]
, 因此筛选有
效抗原是研发刺激隐核虫的亚单位疫苗的关键。
微管蛋白的种类主要有: α-微管蛋白, β-微管
蛋白以及γ-微管蛋白。α-微管蛋白和β-微管蛋白
通过GTP 结合位点聚合形成α/β-异二聚体构成
微管骨架
[22]
。微管蛋白是真核生物细胞骨架等亚
细胞器的重要组成部分, 也是原生动物纤毛和鞭
毛的主要成分, 它在保持细胞形态, 参与细胞分
裂、胞内运输、纤毛和鞭毛的运动中起到重要作
用
[23]
。早在1995年, Balaban等
[24]
研究表明锥虫
的膜下微管可以作为治疗锥虫病的特殊非突变靶
位点。随后的时间里, 越来越多的研究者对微管
蛋白作为原生动物潜在抗原进行研究证实。
Rasooly和Balaban
[25]
利用布氏锥虫(Trypanosoma
brucei)的一种微管结合蛋白MAP p15免疫小鼠,
发现可以100％的保护宿主免受多种异株布氏锥
虫侵染。Li等
[26]
研究表明体外构建重组载体原核
表达伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)微管蛋白能够
诱导小鼠对锥虫产生免疫反应。然而, 目前关于
刺激隐核虫微管蛋白抗原性的研究较少。因此,
寻找刺激隐核虫的微管蛋白验证其免疫原性并作
为潜在靶抗原疫苗是本研究的主要目的。
1 材料与方法
1.1 实验材料
本研究使用的包囊收集自暴发刺激隐核虫病
害的宁德海区。将收集的包囊用斜带石斑鱼
(Epinephelus coioides)传代培育获得滋养体和纤
毛幼虫, 保存于液氮中。
1.2 总RNA提取及cDNA第一条链的合成
采用 Total RNA kitⅡ (OMEGA, 美国)试剂
盒, 分别抽取滋养体、包囊、纤毛虫的总RNA。
使用ND-1000分光光度计来确定获得的RNA纯
度和浓度。对提取的RNA溶液进行琼脂糖凝胶电
泳, 进一步验证RNA的质量。获得的RNA样品
于–80℃保存备用。按照RevertAid First Strand
cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Lithuania)
试剂盒说明书以20 μL体系逆转录反应合成
cDNA第一条链, 反应体系为: 总RNA1 μg, 5×
Reaction Buffer 4 μL, Random Hexamer Primer
(0.2 μg/μL) 1 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 2 μL,
RevertAid Reverse Transcriptase 1 μL, RiboLock
RNase Inhibitor 1 μL, RNase Free dH
2
O定容至20 μL。
反应条件为25℃ 10 min, 42℃ 45 min, 70℃ 15 min,
16℃ 15 min, 逆转录反应结束后置于−20℃保存。
1.3 α-微管蛋白基因cDNA全长片段的扩增、克
隆和序列测定
根据实验室已有的刺激隐核虫转录组数据库,
筛选获得与其他原生动物的基因具有90%以上一
致性的α-微管蛋白基因部分序列。为验证该序列
的准确性, 利用Primer Premier 5. 0软件设计特异
性上游引物tubulin-F1和下游引物tubulin-R1(表
1)。PCR反应程序: 95℃变性5 min; 95℃ 30 s,
55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35个循环; 72℃延伸3 min。
产物经琼脂糖凝胶电泳检测。使用琼脂糖凝胶
DNA回收试剂盒(Promega, USA)回收目的片段并
连接于pMD19-T载体, 将其转化到Escherichia
coli DH5α感受态细胞, 挑取阳性单克隆送往生工
生物工程(上海)股份有限公司测序。
以刺激隐核虫纤毛虫阶段样品总RNA逆转
录分别制备3RACE和
5RACE cDNA模板, 方法
参考刘春云等
[27]
。根据SMARTⅡ Oligonucleotide,
运用Primer 5.0软件, 在已有中间序列测序结果
的基础上, 设计3RACE引物outer-F1和inner-F2,
5RACE 基因特异性引物outer-R1和inner-R2(表
1)。根据巢式PCR原理, 进行第一轮Outer PCR
和第二轮Inner PCR, 具体反应步骤参考刘春云
等
[27]
。用上述方法挑取阳性单克隆送往生工生物
工程(上海)股份有限公司测序。所有引物均由铂
瑞生物技术(厦门)有限公司合成。
1174 中国水产科学
表1 用于α-微管蛋白基因cDNA克隆和实时荧光定量PCR的引物序列
Tab. 1 Primers used for α-tubulin gene cDNA cloning and qRT-PCR
第25卷
引物 primer 序列(5ʹ-3ʹ) sequence (5ʹ-3ʹ) 用途 usage
tubulin-F1 GGAAGGAGGACGCTGCGAACAACTAC 中间序列扩增middle sequence amplification
tubulin-R1 CGAGGAGGACGTCGAGGAGTACTAG
outer-F1 TTCCTGGTGTTCAACTCGGTGGGC
中间序列扩增middle sequence amplification
3ʹRACE
inner-F2 CGTCGTTGAGCCGTACAACAGCGTG 3ʹRACE
outer-R1 AGGCACAGGTCCACGATCTCCTTCC 5ʹRACE
inner-R2 GTGAACCCCAGCTTCGACTTGC
tubulin-F2 AAGTGCGGGATCAACTACCA
tubulin-R2 GCACGCTTCGAGTACATCAG
18S-R GGGCCAGCCTCGATCC
5ʹRACE
qRT-PCR
qRT-PCR
qRT-PCR内参基因 the reference gene for qRT-PCR
18S-F GATCTTAAACCAATATTCCTTCGGG qRT-PCR内参基因 the reference gene for qRT-PCR
1.4 序列拼接与生物信息学分析
利用Sequencher
TM
软件将测序结果进行拼
接, 对拼接获得的核酸序列用ORF Finder 程序
(/orffinder/)确定开放
阅读框(Open Reading Frame, ORF); BLAST
(/)对推导的
氨基酸序列进行同源性分析; 使用ExPASy(
/compute_pi/)预测等电点及分子量;
SMART 程序(/)预
测蛋白质的结构域; SignalP 4.1 Server (http:/ /
/services/SignalP/)预测信号肽;
TMHMM Server v.2.0 (/services/
TMHMM/)进行跨膜区预测; ProtScale (web.
/protscale/)预测蛋白的亲/疏水性; 使用
PBIL的在线分析工具SOPMA 预测氨基酸序列
的二级结构(/cgi-bin/npsa_
?page=npsa_); 使用SWISS-
MODEL (http: ///)进行蛋白
质三级结构构建。通过BioEdit 软件进行序列的
多重比对, 使用MEGA 7.0软件构建系统进化树。
1.5 α-微管蛋白基因的原核表达及鉴定
1.5.1 重组载体pET30a/α-tubulin的构建及鉴定
根据大肠杆菌(Escherichia coli)密码子的偏好性,
利用MaxCodonTM Optimization Program (V13)软件
对α-微管蛋白基因序列的密码子进行优化, 送往
德泰生物科技(南京)有限公司进行全基因合成;
并在目的基因片段的两端加入限制性酶切位点
Nde I和Hind III, 通过此二酶切位点将目的基因插
入到表达载体
pET30a中, 之后将构建的重组质
粒pET30a/α-tubulin导入大肠杆菌BL21(DE3)感
受态细胞中。再利用限制性酶切位点Xho I和Xba I
双酶切验证重组质粒pET30a/α-tubulin是否构建
成功。将含有重组质粒pET30a/α-tubulin的BL21
(DE3)菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公
司进行测序, 以确定最终表达载体的准确性。
1.5.2 重组载体pET30a/α-tubulin的表达及鉴定
将构建成功的重组质粒pET30a/α-tubulin导入大肠
杆菌表达菌株BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态
细胞中, 挑选单克隆分别接种于LB培养液(含50
μg/mL的硫酸卡那霉素)和TB培养液(含50 μg/mL的
硫酸卡那霉素)中。单克隆菌液BL21(DE3)/
pET30a/α-tubulin 和Rosetta(DE3)/pET30a/α-tubulin
作为实验组, 用相同的方法得到空载体单克隆菌
液BL21(DE3)/pET30a和Rosetta(DE3)/pET30a作
为阴性对照组。待培养至OD
600
为0.5~0.8, 向培
养液中加入终浓度0.1 mmol/L IPTG, 分别置于15℃
和37℃, 200 r/min, 诱导表达16 h。最后, 用
SDS-PAGE分析鉴定诱导表达结果。
1.6 刺激隐核虫α-微管蛋白基因在不同生活史
的mRNA表达水平
将滋养体、包囊、纤毛虫的总RNA按照刘春
云等
[27]
方法制备定量PCR模板。利用荧光实时定
量PCR技术(qRT-PCR)在LightCycler480 实时定
量PCR仪(罗氏, 美国)对α-微管蛋白基因在不同
生活史的表达水平进行检测。tubulin-F2和tubulin-R2
为α-微管蛋白基因定量PCR引物(引物序列见表
第6期 孙嘉阳等: 刺激隐核虫α-微管蛋白基因的克隆、原核表达及在生活史不同阶段的mRNA表达 1175
1), 18S-F和18S-R为内参基因18S rRNA的引物
(引物序列见表1)。具体反应体系参照刘春云等
[27]
:
95℃, 1 min; 95℃ 15 s, 59℃ 10 s, 72℃ 10 s, 40
个循环, 每个生活史分别设置4个平行样品。根
据Roche 480实时定量PCR仪自动给出每个样品
的C
p
值计算RQ值(2
–C
t
, C
t
=样品目的基因的
C
t
值-内参基因18S C
t
值, C
t
=每一个样品的C
t
值-基准样品的C
t
值)。基因表达水平均用RQ平
均值±标准误(
x
±SE)来表示, 并通过SPSS 18.0软
件检测样品间的显著性差异, P<0.05为显著性
差异。
2 结果与分析
2.1 刺激隐核虫α-微管蛋白基因全长cDNA序列
分析
以验证成功的1073 bp中间序列为基础, 采
用RACE方法获得α-微管蛋白基因3ʹ和5ʹ端。经
软件Sequencher
TM
拼接得到全长为1602 bp的
cDNA序列。经ORF Finder分析, 该序列ORF为
1356 bp, 编码451个氨基酸, 5ʹUTR为51 bp, 3ʹUTR
为195 bp。ExPASy预测该基因所编码的氨基酸蛋
白分子量为49.78 kD, 等电点为4.9 (图1)。
图1 刺激隐核虫α-微管蛋白基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列
加粗体为起始密码子ATG; *为终止密码子TAG; 单下划线部分为GTP酶结合区;
双划线部分为C端结构域; 阴影部分为GTP 核苷酸结合位点(GGGTGSG).
Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acids sequences of α-tubulin in Cryptocaryon irritans
The bold fonts indicated the start codon (ATG); asterisk indicated the stop codon (TGA); the GTPase domain is single
underlined; the C-terminal domain is double underlined; GTP nucleotide binding site (GGG
TGSG) is outlined in gray.
1176 中国水产科学 第25卷
使用ProtScale预测刺激隐核虫α-微管蛋白的
亲/疏水性, 结果显示亲水性氨基酸残基所占面积
大于疏水性氨基酸残基, 推测其属于亲水性蛋白
质(图2)。使用TMHMM预测α-微管蛋白序列跨
膜域, 结果显示其蛋白序列的肽链跨膜的概率低
于0.5, 且预测跨膜螺旋中的氨基酸残基数为1.59
个, 表明α-微管蛋白不具有明显的跨膜结构(图
3)。使用SignalP预测发现α-微管蛋白不存在信号
肽, 预测其不是分泌型蛋白。
图2 刺激隐核虫α-微管蛋白疏水性/亲水性分析
Fig. 2 The hydrophobicity/hydrophilicity analysis of
α-tubulin in Cryptocaryon irritans
图3 刺激隐核虫α-微管蛋白跨膜区分析
Fig. 3 Prediction analysis of transmembrane region of
α-tubulin in Cryptocaryon irritans
通过ScanProsite软件对α-微管蛋白的氨基酸
序列进行结构预测分析, 结果表明在第142至
148位氨基酸序列区域内, 存在特有的保守区
域—GTP核苷酸结合位点GGGTGSG。用SMART
预测α-微管蛋白有2个显著的结构域家族,
Phe49-Gly246位氨基酸为Tubulin/FtsZ 家族GTP
酶结构域; Leu248-His393位氨基酸为Tubulin/FtsZ
家族C-末端结构域(图1)。使用PBIL 的在线分析
工具SOPMA 对氨基酸序列的二级结构进行预测,
SWISS-MODEL软件的同源建模构建蛋白质三级
结构, 结果显示α-微管蛋白是由45.01%的α-螺旋,
28.60%的无规卷曲, 16.63%的延伸链和9.76%的
β-转角组成(图4)。
图4 预测的刺激隐核虫α-微管蛋白的三级结构
Fig. 4 Predicted three-dimensional structure of the
α-tubulin in Cryptocaryon irritans
2.2 刺激隐核虫α-微管蛋白基因编码的氨基酸
序列同源性及其进化树分析
经过BLAST分析, 发现刺激隐核虫α-微管蛋
白与尾刺耐格里原虫(Naegleria gruberi)、眼虫
(Euglena gracilis)α-微管蛋白氨基酸序列的一致
性最高, 为95%; 与间日疟原虫(Trypanosoma vivax)、
丹氏锥虫(Trypanosoma danilewskyi)、八肋游仆虫
(Euplotes octocarinatus)一致性也高达94%; 使用
BioEdit软件将刺激隐核虫α-微管蛋白氨基酸序
列分别与人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、
斑马鱼(Danio rerio)、东美螈(Notophthalmus
viridescens)、家蚕(Bombyx mori)和丹氏锥虫等动
物的16条α-微管蛋白序列进行同源性比对分析
(表2), 结果显示刺激隐核虫α-微管蛋白的氨基酸
序列与其他物种的α-微管蛋白的氨基酸序列具有
较高一致性(图5), 表明α-微管蛋白具有较高的保
守性。使用
MEGA7.0软件以NJ法构建17 种生
物α-微管蛋白氨基酸序列的分子系统进化树(图
6)。进化树结果表明, 脊椎动物中哺乳类人和小
鼠、鸟类波斑鸨(Chlamydotis macqueenii)、两栖类
东美螈和非洲爪蟾(Xenopus laevis)以及鱼类斑马
鱼聚为一支; 无脊椎动物中环节动物家蚕、节肢
第6期 孙嘉阳等: 刺激隐核虫α-微管蛋白基因的克隆、原核表达及在生活史不同阶段的mRNA表达 1177
动物果蝇(Drosophila melanogaster)以及头索动物
亚门的文昌鱼(Branchiostoma floridae)聚为一支;
刺激隐核虫与原生动物草履虫(Paramecium
tetraurelia)、四膜虫(Tetrahymena thermophila)、
八肋游仆虫、丹氏锥虫、眼虫、尾刺耐格里原虫、
间日疟原虫聚为一支(图6)。由17个代表物种的
α-微管蛋白氨基酸序列所反映的系统发育关系与
生物在进化上的地位关系相一致。
表2 刺激隐核虫α-微管蛋白氨基酸序列多重
比对和系统进化树所用物种信息
Tab. 2 Species information for multiple sequence
alignment and phylogenetic analysis for α-tubulin
of Cryptocaryon irritans
物种 species 登录号 accession number
人Homo sapiens AAA91576.1
小鼠Mus musculus NP_035784.1
斑马鱼Danio rerio AAB84143.1
东美螈Notophthalmus viridescens Q91060.1
波斑鸨Chlamydotis macqueenii KFP42342.1
非洲爪蟾Xenopus laevis NP_001081575.1
家蚕Bombyx mori NP_001036885.1
果蝇Drosophila melanogaster NP_476772.1
文昌鱼Branchiostoma floridae AAM73981.1
草履虫Paramecium tetraurelia CAA67848.1
四膜虫Tetrahymena thermophila XP_001022424.1
八肋游仆虫Euplotes octocarinatusQ08114.1
丹氏锥虫Trypanosoma danilewskyiABA00480.1
眼虫Euglena gracilis AAK37831.1
尾刺耐格里原虫Naegleria gruberiXP_002675196.1
间日疟原虫Trypanosoma vivax CCC46465.1
2.3 α-微管蛋白基因的原核表达及鉴定
2.3.1 重组表达载体的鉴定 将已构建好的重组
质粒pET30a/α-tubulin通过Xho I和Xba I双酶切
鉴定表达载体构建的准确性, 结果显示, 酶切下
的基因片段大小与目的基因大小1356 bp一致(图
7)。在此基础上, 将含有重组质粒pET30a/
α-tubulin的BL21(DE3)菌液送往生工生物工程(上
海)股份有限公司进行测序。测序结果显示, 含有
1356 bp的α-微管蛋白基因ORF片段成功插入到
pET30a表达质粒上且序列正确。说明α-微管蛋白
基因成功亚克隆到pET30a表达载体上。可以进
行下一步原核表达蛋白。
2.3.2 SDS-PAGE分析重组表达蛋白 将pET30a/
α-tubulin转化至BL21(DE3)和Rosetta(DE3)表达
感受态细胞, 诱导16 h可以获得较好的蛋白表达
量。对重组蛋白SDS-PAGE电泳图(图8 , 图9)
分析发现, 诱导表达的重组蛋白分子量约为50
kD (箭头所示), 与软件预测的蛋白分子量大小相
一致, 说明
α-微管蛋白诱导表达成功。进一步分
析发现在BL21(DE3)表达菌株中15℃与37℃下
诱导表达的重组蛋白电泳条带相差不大(图8), 说
明在BL21(DE3)表达菌株中15℃和37℃诱导表
达的效果相近。但在Rosetta(DE3)表达菌株中
15℃下诱导表达的重组蛋白电泳条带颜色明显较
37℃深(图9), 说明在Rosetta(DE3)表达菌株中
15℃条件下诱导表达效果更好。而使用LB培养
液或TB培养液培养表达菌体对重组蛋白的诱导
表达影响不大。
2.4 α-微管蛋白基因在刺激隐核虫3个生活史时
期的表达
以18S为内参基因, qRT-PCR结果显示(图10),
α-微管蛋白基因在刺激隐核虫3个生活史时期均
有表达, 其中在纤毛幼虫时期的表达量显著高于
包囊和滋养体时期(P<0.05)。
3 讨论
微管蛋白是细胞微管骨架, 纤毛和鞭毛的重
要组成部分, 参与胞内运输、细胞分裂以及纤毛
和鞭毛的运动等生命活动
[28]
。Kim等
[29]
研究发现
水滴伪康纤虫(Pseudocohnilembus persalinus) β-
微管蛋白具有较好的免疫原性, 可作为靶抗原疫
苗预防海水鱼类的纤毛虫病。Plouffe等
[30]
发现丹
氏锥虫的α、β-微管蛋白均具有免疫原性, 微管蛋
白可能作为靶位分子控制鱼的锥虫病。本研究克
隆得到的刺激隐核虫基因编码451个氨基酸。在
氨基酸序列第142~148位处存在一个微管蛋白特
有的保守区域: GTP核苷酸结合位点α-微管蛋白
(GGGTGSG), 它是α、β-微管蛋白结合形成二聚
体的重要结构
[31]
。通过BLAST分析, 发现刺激隐
核虫α-微管蛋白氨基酸序列与尾刺耐格里原虫、
间日疟原虫、锥虫等原生动物的序列一致性高达
94%~95%; 与人、小鼠、斑马鱼等非原生动物序
列一致性达78%~86%, 说明α-微管蛋白具有较高
的保守性。
1178 中国水产科学 第25卷
图5 刺激隐核虫与其他物种的α-微管蛋白序列多重比对
Fig. 5 Multiple alignment of the α-tubulin amino acid sequence between Cryptocaryon irritans and other species
第6期 孙嘉阳等: 刺激隐核虫α-微管蛋白基因的克隆、原核表达及在生活史不同阶段的mRNA表达 1179
图6 刺激隐核虫α-微管蛋白基因氨基酸序列的系统进化树
Fig. 6 Phylogenetic tree analyses of the α-tubulin amino acid sequence in Cryptocaryon irritan
图7 pET30a/α-tubulin重组质粒双酶切鉴定
M: 标准分子量DNA; 1: 超螺旋的重组质粒
pET30a/α-tubulin; 2: pET30a/α-tubulin经Xho I
和Xba I双酶切后的结果.
Fig. 7 Identification of the recombinant plasmid
pET30a/α-tubulin by double restriction digestion
M: DNA ladder; 1: Recombinant plasmid pET30a/α-tubulin of
supercoiling; 2: Recombinant plasmid pET30a/α-tubulin di-
gested by both XhoI and XbaI.
图8 SDS-PAGE分析α-微管蛋白在
BL21(DE3)中的表达
M: 蛋白质分子量标准; 1: 阴性对照(BL21(DE3)/ pET30a诱
导16 h); 2: 阴性对照(未加IPTG诱导剂); 3: 15℃,
0.1 mmol/L IPTG诱导BL21(DE3)/ pET30a /α-tubulin 表达
16 h, LB培养液; 4: 37℃, 0.1 mmol/L IPTG诱导BL21(DE3)/
pET30a /α-tubulin表达16 h, LB培养液; 5: 15℃, 0.1 mmol/L
IPTG诱导BL21(DE3)/ pET30a /α-tubulin表达16 h, TB培养
液; 6: 37℃, 0.1 mmol/L IPTG诱导BL21(DE3)/
pET30a /α-tubulin表达16 h, TB培养液.
Fig. 8 SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression of
α-tubulin in Escherichia coli BL21(DE3)
M: protein marker; 1: the negative control BL21(DE3)/pET30a
induced for 16 h); 2: the negative control (not add IPTG revul-
sant); 3: BL21(DE3)/pET30a/α-tubulin induced by 0.1 mmol/L
IPTG for 16 h at 15℃, LB medium; 4: BL21(DE3)/pET30a/
α-tubulin induced by 0.1 mmol/L IPTG for 16 h at 37℃, LB
medium; 5: BL21(DE3)/pET30a /α-tubulin induced by
0.1 mmol/L IPTG for 16 h at 15℃, TB medium; 6:
BL21(DE3)/pET30a/α-tubulin induced by 0.1 mmol/L
IPTG for 16 h at 37℃, TB medium.
刺激隐核虫的纤毛幼虫时期以纤毛作为运动
细胞器在海水中自由游动, 寻找并侵染宿主鱼。
Bai等
[32]
研究表明, 以刺激隐核虫纤毛幼虫时期
制备的抗原疫苗比包囊和滋养体时期的疫苗能使
宿主鱼获得更好的免疫保护。Mai等
[33]
研究发现
刺激隐核虫纤毛幼虫、包囊以及滋养体蛋白分别
与相应的兔抗血清进行免疫杂交, α/β微管蛋白只
1180 中国水产科学 第25卷
图9 SDS-PAGE分析α-微管蛋白在Rosetta
(DE3)中的表达
M: 蛋白质分子量标准; 1: 阴性对照(Rosetta (DE3)/pET30a
诱导16 h); 2: 阴性对照(未加IPTG诱导剂); 3: 15℃,
0.1 mmol/L IPTG诱导Rosetta (DE3)/pET30a/α-tubulin 表达
16 h, LB培养液; 4: 37℃, 0.1 mmol/L IPTG诱导Rosetta
(DE3)/pET30a /α-tubulin表达16 h, LB培养液; 5: 15℃,
0.1 mmol/L IPTG诱导Rosetta (DE3)/pET30a/α-tubulin表达
16 h, TB培养液; 6: 37℃, 0.1 mmol/L IPTG诱导Rosetta
(DE3)/pET30a/α-tubulin表达16 h, TB培养液.
Fig. 9 SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression of
α-tubulin in Escherichia coli Rosetta (DE3)
M: protein marker; 1: the negative control Rosetta
(DE3)/pET30a induced for 16 h); 2: the negative control (not
add IPTG revulsant); 3: Rosetta (DE3)/pET30a/α-tubulin in-
duced by 0.1 mmol/L IPTG for 16 h at 15℃, LB medium; 4:
Rosetta (DE3)/pET30a/α-tubulin induced by 0.1 mmol/L IPTG
for 16 h at 37℃, LB medium; 5: Rosetta
(DE3)/pET30a/α-tubulin induced by 0.1 mmol/L IPTG for 16 h
at 15℃, TB medium; 6: Rosetta (DE3)/pET30a/α-tubulin in-
duced by 0.1 mmol/L IPTG for 16 h at 37℃, TB medium.
图10 qRT-PCR检测刺激隐核虫在3个生活史
时期α-微管蛋白基因相对表达量
柱上不同小写字母表示不同时期存在显著差异(P<0.05).
Fig. 10 The relative expression levels of α-tubulin
in Cryptocaryon irritans during the three phases of
life history by qRT-PCR.
Histogram bars with different small letters indicate
significant differences (P<0.05).
在纤毛幼虫时期检测出来, 表明微管蛋白可能是
纤毛幼虫时期的特异性抗原成分。本实验结果显
示纤毛幼虫时期的α-微管蛋白基因相对表达量显
著高于包囊和滋养体时期, 结合Bai
[34]
和Mai
[35]
等研究结果，推测刺激隐核虫纤毛幼虫时期的α-
微管蛋白基因可作为潜在的靶抗原疫苗。
本研究成功诱导重组表达载体pET30a/α-
tubulin在表达菌株BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中
原核表达。Katzenback等
[34]
研究首次将体外重组
表达的丹氏锥虫微管蛋白作为疫苗对金鱼(Carassius
auratus L.)进行腹腔注射活体实验, 发现原生动
物寄生虫类微管蛋白对金鱼具有刺激免疫作用。
Kurup等
[35]
研究表明制备伊氏锥虫微管蛋白基因
DNA疫苗能够诱导小鼠产生保护性免疫反应。这
些研究为刺激隐核虫微管蛋白用于养殖生产上的
实用型疫苗提供了理论依据，本研究后续还将对
此α-微管蛋白进行大量的原核表达和蛋白纯化,
进一步地通过对宿主鱼体内活体注射检测以及体
外ELISA检测等实验多角度全方位地验证α-微管
蛋白具有免疫原性, 为深入研究微管蛋白基因的
功能以及制备“白点病”疫苗奠定基础。
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SUN Jiayang
1
, ZHANG Ziping
2
, ZHU Youfang
3
, ZOU Zhihua
1
, HAN Kunhuang
1
, GE Hui
4
, WANG Yilei
1
1. Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China;
2. Animal Science College, Fujian University of Agriculture, Fuzhou 350002, China;
3. Putian Institute of Fishery Sciences, Putian, 351100, China;
4. Fujian Fisheries Research Institute, Xiamen, 361013, China
Abstract: Cryptocaryon irritans is an extremely destructive ciliate parasite of marine fishes, which results in se-
vere economic costs in mariculture. Its life history is divided into three stages: trophont, tomont, and theront. Tu-
bulin is a major component of the cytoskeleton, cilia, and flagella, which plays an important role in maintaining
cell morphology, intracellular trafficking, cell division, ciliary, and flagella motility. At the same time, many stud-
ies showed that tubulin has immunogenicity and can be used as a target antigen vaccine. In this study, the
α-tubulin gene fragment was obtained from the C. irritans transcriptome data in our laboratory. Full-length cDNA
of α-tubulin C. irritans was cloned for the first time by 5RACE and 3RACE. The results showed that full-length
cDNA of α-tubulin is 1602 bp containing a 1356 bp open reading frame, which encodes proteins with 451 amino
acids. The predicted molecular mass of α-tubulin is 49.78 kD. Bioinformatics analysis showed that it is a hydro-
philic non-transmembrane protein. The amino acid sequence at positions 142148 has a unique conserved GTP
nucleotide binding site (GGGTGSG). Multiple sequence alignment analysis and phylogenetic analysis revealed
that the α-tubulin in C. irritans was integrated with other protozoa in the phylogenetic tree and had 94%95%
sequence identity with Trypanosoma vivax, T. danilewskyi, Euplotes octocarinatus, Naegleria gruberi, and Eu-
glena gracilis. The real-time quantitative PCR technique was used to detect the expression of α-tubulin gene in the
life history of C. irritans. The results showed that α-tubulin gene expression was significantly higher in the theront
stage than in the tomont and trophont stages (P < 0.05). Furthermore, the α-tubulin recombinant expression vector
was constructed and transformed into the BL21 (DE3) and Rosetta (DE3) of the Escherichia coli expression strain
for prokaryotic expression. SDS-PAGE analysis showed that the molecular weight of the recombinant protein was
approximately 50 kD, which was consistent with the predicted result, indicating that α-tubulin protein induced
expression successfully. The results of this study laid the foundation for the subsequent preparation of an effective
subunit vaccine.
Key words: Cryptocaryon irritans; α-tubulin; prokaryotic expression; life history; real-time quantitative PCR
Corresponding author: WANG Yilei. E-mail: ylwang@
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