2024年6月1日发(作者：)

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华北煤炭医学院学报２００７年１月第９卷第１期Ｊ　Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｎａ　Ｃｏａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　２００７　Ｊａｎｕａｒｙ，９（１）　

轮状病毒分离与培养方法的建立　

裴银辉　吴景华　苏兆林马立人　

（华北煤炭医学院生物科学系河北唐山０６３０００）　

［摘要】①目的探讨建立轮状病毒的分离与培养方法。②方法粪便标本经ＥＬＩＳＡ检测，离心后接种于ＭＡ１０４细胞株，现察病毒致细　

胞病变效应。提取病毒ＲＮＡ，琼脂糖电泳检测。③结果经离心、甄抗处理后，轮状病毒可在ＭＡ１ｏ４细胞中克隆增殖．并引起细胞病变　

（ＣＰＥ）。④结论ＭＡ１０４作为客纳细胞，可用于轮状病毒的大量扩增。　

［关键词】腹泻轮状病毒病毒培养　

【中圈分类号】Ｒ　３３［文献标识码】Ａ［文章编号］１００８—６６３３（２ＯＯ７）０１—０００７—０２　

Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｏｔａｖｉｒｕｓ　Ｐ　Ｈ　，　Ｕ．＾ｎｇＪｌ妣，ＳＵ　Ｚｈａｏｌｉｎ，ｅｔ　ａｌ（Ｄｅ—　

ｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏｒｔｈ　Ｃｏａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｔａｎｇｓｈａｎ　０６３０００，　ｎａ）　‘　

『ＡＢＳＴＴＡｃＴ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｎａｄ　ｉｎｃｕｂａｔｅ　ｒｏｔａｖｉｒｕｓ．Ｍｅｔｈｏｄ　Ｓｐｅｃｉｍｅｎ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＥＬＩＳＡ　

ｎａｄ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｔｏ　ＭＡ１０４，ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ＣＰＥ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ｖｉｒｕｓ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓ　ＷａＳ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ａｎｄ　ａｇａｒ　ｓｕｇａｒ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ－　

ｒｅｓｉｓ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔ　Ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｏｄ　ｂｙ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｉｎ—ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．ｒｏｔａｖｉｒｕｓ　Ｗｇ８　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｓｔｏｏｌ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ　

ｉｎ　ＭＡ１０４　ｃｅＵｓ　ａｎｄ　ｃａｕｓｅｄ　ＣＰＥ　ａｓ　ａ　ｒｅｓｕｌｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ａｓ　ａ　ｋｉｎｄ　ｏｆ　ａｄｏｐｔｉｖｅ　ｃｅｌ１．ＭＡ１０４　ｃａｌｌ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｒｏｔａｖｉｒｕｓ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ　

ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．　

１　ｌ【ＥＹ　ＷＯＲＩＤＳ　ｌ　Ｄｉａｒｒｈｅａ．Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｕｓ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　

轮状病毒是引起２岁以下儿童病毒性腹泻的主要病原体，　

２结果　

主要存在于病毒性腹泻患儿粪便中。每年都有许多儿童死于轮　２．１病毒细胞培养结果见图１、图２。　

状病毒感染，但是至今还没有治疗轮状病毒感染的有效手段。　

因此，加强对轮状病毒感染的主动免疫预防极为重要。本实验　

通过建立轮状病毒的分离及其培养方法，旨在为进一步进行轮　

状病毒疫苗的研制奠定基础。　

１材料与方法　

１．１材料　

１．１．１试剂。ＭＡ一１０４细胞株（购于中国病毒所）、轮状病毒　

ＥＬＩＳＡ检测试剂盒（北京万泰生物制品公司）、ＤＥＭＥ培养基　

（ＧＩＢＣ公司）、胎牛ｍ清（中科院生物制品公司）、Ｔｆｉｚｏｌ试剂（天　

津荆申生物公司）。　

１．１．２标本。腹泻患者粪便样本（取自唐山市妇幼保健医　

院）。　

圈１　ＭＡ１０４细胞正常形态　图２轮状病毒感染ＭＡ１０４细胞　

１．２方法。　

后ＣＰＥ　

１．２．１标本处理。取腹泻患者粪便标本，立即用轮状病毒　

２．２病毒ＲＮＡ电泳经电泳检测，琼脂糖并不能将病毒ＲＮＡ　

ＥＬＩＳＡ诊断试剂盒检测。取阳性标本离心，５ｍＬ样品中加入　

的１１个条带完全分开。紫外分光仪下观察得到１　０００ｂｐ处可　

５ｍＬ　Ｈａｎｋｓ液，ｌ　Ｏ００ｒ／ｍｉｎ离心１０分钟，取上清，３　Ｏ００ｒ／ｍｉｎ离　

见１条明显的亮带，其余在５００ｂｐ及２０００ｂｐ附近有连续的亮　

心２０分钟，取上清，４℃１０　０００ｒ／ｒａｉｎ离心１小时，取上清。抗生　

带，形成亮斑，为未分离的ＲＮＡ。　

索（１．８ｍＬ上清中加入０．２ｍＬ浓度为２５　０００ｍｇ／Ｌ的双抗），于　

３讨论　

４℃条件下作用１小时。　

轮状病毒（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）是呼肠科（Ｒｅｏｖｉｉｆｄａｅ）的一个新属，由　

１．２．２病毒接种与培养。取抗生素处理后的病毒，以每瓶２～　

Ｂｉｓｈｏｐ等在１９７３年发现的¨Ｊ。它具有呼肠科病毒的形态，呈球　

４ｍＬ的量接种细胞培养瓶中，置ＣＯ　培养箱中３７℃培养，及时　

形，大小为６Ｏ一８０　ｎｍ，元包膜和多层核衣壳等生物学特性，由　

蛋白质外壳和核酸组成，其基因组由大小形态相似和分节段的　

观察细胞病变（ＣＰＥ）。　

１．２．３病毒ＲＮＡ提取。ＣＰＥ达到７０％一８０％即可分离提取病　

ＲＮＡ基因结构，共ｌ１个基因片段组成，可以在宿主细胞浆中复　

毒。病变细胞用Ｔｆｉｚｎｌ试剂常规提取总ＲＮＡ。　

制。实验结果表明，轮状病毒可以经感染恒河猴胚肾细胞（ＭＡ　

一

１．２．４琼脂糖电泳。配制１％琼脂，制胶，以每孔５　的量加　

１０４）而大量增殖。镜下，正常的ＭＡ一１０４细胞为梭形，贴于　

样及标准ｍａｒｋｅｒ。１００Ｖ电泳４Ｏ一５Ｏ分钟，然后在紫外分光仪　

培养瓶底部，胞质清亮，细胞间界限明显，可见细胞核位于细胞　

中央地带（见图１）。细胞经轮状病毒感染后３～４天即可出现　

下观察条带。　

细胞病变（ＣＰＥ），病变的细胞形态变圆，边缘粗糙，细胞质颜色　

【基金现日¨可北省］！生厅课题（编号：２００４１５７）。　

由浅变深，细胞变得暗淡、模糊，核消散（见图２），细胞生长缓　

【作者简介】裴银辫（１９７０一），男，硕　，副教授。主要研究方向：抗感染　

慢。病毒的感染速度随接种量及不同样本而变化，一般每瓶细　

免疫。　

胞以２ｍＬ的接种量，３—４天出现病变灶；以４ｍＬ的接种量，一　

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８・华北煤炭医学院学报２００７年１月第９卷第１期Ｊ　ＮｏＡｈ　Ｃｈｉｎａ　Ｃｏａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　２００７　Ｊａｎｕａｒｙ，９（１）　

般２天即可出现病变灶，部分３天以后出现。　但分辨率较高，将ｌ１条带分离出来呈４—２—３—２排布，但中分　

经电泳检测，琼脂糖并不能将１１个条带完全分开。紫外分　

子量处３条区带分离效果不佳，对以后分子生物学实验所需的　

光仪下观察得到１０００ｂｐ处有１条明显的亮带，其余在５００ｂｐ及　

Ｖｐ７的分离造成影响。　

２０００ｂｐ附近有连续的亮带，形成亮斑，为未分离开的ＲＮＡ。聚　

参考文献　

丙稀酰胺垂直凝胶电泳的分离效果较好，紫外分光仪下观察到　

［１］Ｇｃｎｔｓｃｈ　ＪＲ，Ｗｏｏｄｓ　ＰＡ，Ｒａｍａｅｈａｎｄｒａｎ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆＧ　ａｎｄ　Ｐ　

１１条亮带，呈４—２—３—２排布，只有中分子量附近３条条带分　

ｔ）ｒ—ｐｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｒｏｍ　ｏ　ｇｌｏｂａｌ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｏｔａｖｉｎｓ　ｓｔｒａｉｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　

离不明显＿（　。　

ｆｏｒ　ｖａｃｄｉｎｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．ＩｎｆｅｃｔＤｉｓ，１９９６，１７４（１）：３０　

琼脂糖电泳简单易行，分离范围较大，但对于轮状病毒来说　

［２］Ｂａｌｌ埘，Ｔｉａｎ　Ｐ，Ｚｅｎｇ　ＣＱ，ｅｔ　ｓ１．Ａｇｅ—ｄｅｐｅｎｄｃｎｔｄｉａｒｒｈｅａ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　

分辨率不够，不能将１１个条带完全分开，在凝胶及电泳中加入　

＆ｒｏｔａｖｉｒａｌ　ｎｏｎｓｔｍｃｔｕｒａｌ　ｇｌｙｃｏ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７２（４）：　

甲醇后分辨率略有提高，出现４条区带，但仍不能达到要求，该　

１０１　

结构与资料显示的一致，聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作比较复杂，　

（２ＯＯ６—１０—１１收稿）（周济桂编辑）　

血尿酸水平与急性脑梗死相关性研究　

汪茂宝周　农①　

（安徽省淮北市中医医院神经内科淮北２３５０００　ｇ①安徽医科大学神经内科）　

【摘要】①目的探讨血尿酸水平与惠性脑梗死发病覆预后的关系。②方法选取住院惠性脑梗死惑者９４倒为观察组。检测入院２４小　

时内血尿酸水平厦相关指标，并与正常对照组比较和分析两组问的相关性；分别对观察组病例八院第１天厦第２８无进行神经功｜乜缺损评　

分，分析神经功能缺损与八院时血尿酸水平的相关性。③结果急性脑梗死患者血尿酸水平茂异常率明显增高，与对照组之间存在显著差　

异（Ｐ＜Ｏ．０１）；在怠性脑梗死患者中，血尿酸异常组高血压、高脂血症、高纤雏蛋白原血症覆颈动脉粥样斑块的发生率较正常组明蓝增高（Ｐ　

＜０．０１），且前者入院弟２８天神经功能缺损的程度也较重（Ｐ＜０．０１）。④结论血尿酸水平与忠性脑梗死的发病密切相关，参与丁其发病　

机制，是预后不良的预测因素。　

［关麓词】脑梗死血尿酸相关性研究　

［中用分类号】Ｒ　７４３［文献标识码】Ａ［文章编号】１００８—６６３３（２００７）０１一ｏ０ｏ８一ｏ２　

Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ￣ｌｒＵｌｌｌ　ｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ａｃｕｔｅ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ　ｃ　Ｍ￣ｂａｏ　ＺＨＯＵ　弧　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ《　

Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｈｕａｉｂｅ　Ｃｗｗ舶　讧　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ＣＡｆ　ｓｅ　Ｍｅｄ￣ｉｎｅ，Ｈｕａｉｂｅｉ　２３５Ｏｏｏ，Ｃｈｉｎａ）　

［ＡＢＳＴＲＡＣＴ　ｌ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ａｃｕｔｅ　ｃｅｒｅｂｒｌａ　ｉｎ—　

ｆｓｒｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　９４ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｌｌ　ａｃｕｔｅ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｅｎｒｏｌｌｅｄ．Ｍｅｔｌｌｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｓｅｒｌｌＲｌ　ｗｒｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｒｅｌａ－　

ｉｆｖｅ　ｉｎｄｅｘｅｓ　ｉｎ　２４　ｈｏｕｒｓ　ｉｎ　ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｓｅｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ　Ｉｈｅ　ｉｎ－　

ｏｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｒｖｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｖａｌｎｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｉｓｔ　ｄａｙ　ｔｈｅ　２８ｔｈ　ｄａｙ　ｉｎ　ｈｏｓｐｉｔａ１．ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎ・　

ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ．ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｒｖｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｔ￣ｒｌｌｍ　ｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｗ８ｓ　ａｎａｌｙｓｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｓｅｒｌｌｍ　ｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｂｎｏｒ－　

ｅｒａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｃｕｔｅ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ａｎｄ　ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｉｎｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ。ｔｈｅ　ＷＯＹｌｎａｌ　

ｇｒｏｎｐ（Ｐ＜０．Ｏ１）；ｌＩＩ　ｔｌｌｅ　ｃｅｒｅｂｒｌａ　ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ，ｔｈｅ　ｉｎｃｉｄｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｔｉｏｎ，ｈｙｐｅｄｉｐｉｄｅｍｉａ，ｈｙｐｅｒｉｆｂｒｉｎｏｇｅｎｅｍｉａ　ａｎｄ　ａｔｈｅｒｏ－　

ｓｃｌｅｒｏｔｉｃ　ｐｌａｑｕｅｓ　ｉｎｃａｒｏｔｉｄ　ａｒｔｅｒｉｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｂｎｏｒｍａｌ　ｓｅｒｕｍ　ｗｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｇｒｏｕｐ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ（Ｐ＜０．０１），ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｅｇｒｅｅ　ｆｏ　ｔｈｅ　ｉｎ－　

ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｒｖｅｓ　ｗａ８　ｍｕｃｈ　ｍｏｒｅ　ｓｅｒｉｏｕｓ　ｏｎ　ｈｔｅ　２８ｔｈ　ｄａｙ　ｉｎ　ｈｏｓｐｉｔｌａ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｔｉｏｎ　ｎｌｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｓｅｕｒｍ　

ｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｗａｓ　ａ　ｃｌｏｓ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａｃｕｔｅ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｆｎａｒｃｔｉｏｎ．ａｎｄ．ｗａｇ　ｂａｄ　ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ　ｔｈｅ　ｐｒｅｄｉｃｔａｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ．　

［珏Ｙ　ＷＯＲＤＳ］　Ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｎｆａｒ＿ｃｔｉｏｎ．Ｓｅｒｕｍ　ｕｒｉｃ　ａｃｉｄ．Ｃｏ￣ｅｌａｔｉｏｎ　

流行病学研究已经表明…，血尿酸水平与心血管疾病的发　ｌ一８月连续住院的９４例急性脑梗死患者，均符合全国第四届　

病有密切关系　高尿酸血症作为机体代谢紊乱综合征的指标之　脑血管病学术会议各类脑血管病的诊断标准，并经过头部ＣＴ　

一

，

可能与肥胖、高脂血症、脂肪肝、高血压等集结出现，从而构　或ＭＲＩ检查证实。均为首次发病，发病时问＜７２小时。其中男　

成心脑血管病的危险因素。有研究　指出，血尿酸水平是非胰　５０例，女４４例；年龄４８～８４岁，平均（６６．８±１０．６８）岁。并发　

岛紊依赖型糖尿病患者并发脑卒中的预测因子，当血尿酸水平　

高血压病５３例，冠心病２１例，糖尿病２２例，高脂血症３７例。　

＞２９５ｔｔｒａｏｌ／Ｌ时即增加卒中发病的风险。但高尿酸血症与急性　入选病例除外：①多次发作的脑梗死；②继发性脑梗死，如继发　

脑血管病预后的关系尚不十分明确。２００５年１—８月，我们对　

于脑出血、外伤、血管炎、肿瘤、血液病后的脑梗死；③有痛风病　

９４例急性脑梗死患者的血尿酸水平与脑梗死发病及预后的关　

史者或肾功能不全者。另选对照组３Ｏ例，为健康体检者，男１７　

系进行了研究，结果报告如下。　

例，女１３例；年龄４４～７６岁，平均（６５．８±１１．１２）岁。两组年　

１瓷料与方法　

龄、性别差异无显著性（Ｐ＞０．０５），具有可比性。　

１．１一般资料观察组为安徽医科大学附院神经内科２００５年　

１．２　方法　血尿酸采用尿毒酶法测定，异常标准为男性　

＞４２０￣ｍｏｌ／Ｌ，女性＞３６０￣ｍｏｌ／Ｌ。其他指标血常规、肝肾功能、　

【作者简介】汪茂宝（１９６６一），男，本科，副主任医师。主要研究方向：脑　

电解质、血糖、血脂、血ＦＩＢ均以本院全自动生化仪常规检测。　

血管疾病、中枢系统感染、癫痫的诊断与治疗　

所有研究对象（患者于入院２４小时内）均于清晨空腹采肘静脉